酵母表達系統

畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統是近年來(lái)發展迅速、應用(yòng)廣泛的一種真核表達系統。它是甲醇營養型酵母菌，有兩個乙醇氧化酶(Alcohol oxidase，AOX)編碼基因AOX1和(hé)AOX2，兩者序列相似，AOX1基因嚴格受甲醇誘導和(hé)調控。當甲醇爲唯一碳源時(shí)，AOX1啓動子可被甲醇誘導，啓動乙醇氧化酶的表達，從(cóng)而用(yòng)甲醇進行代謝(xiè)，含AOX1啓動子的質粒可用(yòng)來(lái)促進編碼外(wài)源蛋白(bái)的目的基因的表達。

主要優勢：

1.含有特有的強有力的AOX(醇氧化酶基因)啓動子，用(yòng)甲醇可嚴格地調控外(wài)源基因的表達

2.産物易分離，畢赤酵母所用(yòng)發酵培養基十分廉價，一般碳源爲甘油或葡萄糖及甲醇，其餘爲無機鹽，培養基中不含蛋白(bái)，有利于下(xià)遊産品分離純化

3.外(wài)源蛋白(bái)基因遺傳穩定，外(wài)源基因能(néng)以高(gāo)拷貝數整合到(dào)畢赤酵母基因組中，不易丢失并能(néng)夠得到(dào)高(gāo)表達菌株

4.作(zuò)爲真核表達系統，畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結構，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白(bái)磷酸化等翻譯後修飾加工(gōng)功能(néng)

表達菌株特點：

GS115：AOX1和(hé)AOX2基因都正常表達AOX蛋白(bái)(乙醇氧化酶)，甲醇的利用(yòng)效率高(gāo)，接近于野生型，屬于甲醇快(kuài)速利用(yòng)型(Mut+)

KM71：AOX1基因被大(dà)部分剔除，隻能(néng)利用(yòng)AOX2爲AOX編碼，甲醇利用(yòng)速率變慢，表現(xiàn)爲甲醇慢利用(yòng)型(Muts)

外(wài)源基因的整合方式不同會(huì)導緻表達菌株的表型不同：

Table 1. 酵母菌株表型

Table 2. 表達載體信息

對(duì)于胞外(wài)表達的蛋白(bái)除了(le)可以用(yòng)載體自(zì)帶的信号肽，還有以下(xià)信号肽可供選擇：

Table 3 . 信号肽序列

1.具有完備的畢赤酵母表達平台，可以根據蛋白(bái)特性或客戶需求設計(jì)不同的實驗方案

2.具有高(gāo)通量篩選平台，可以快(kuài)速有效地獲得最佳表達條件

3.具有大(dà)規模發酵生産的能(néng)力

案例1：

　　蛋白(bái)A全長基因合成後亞克隆至表達載體pPICZαA，轉化畢赤酵母菌株X33，蛋白(bái)分泌表達成功(28kDa;C端6*His)，産量7mg/L，純度大(dà)于90%，質檢圖如下(xià)：

蛋白(bái)A 純化質檢圖（Reduced SDS-PAGE）

案例2：

　　蛋白(bái)B基因合成後亞克隆至表達載體pPIC3.5K分别轉化畢赤酵母菌株GS115/KM71進行胞内表達，SDS-PAGE檢測結果顯示蛋白(bái)B(糖基化後40kDa)有明(míng)顯表達，其中克隆GS115-5#(24h，0.5%甲醇)，GS115-2#(48h，1%甲醇)，GS115-3#(48h，1%甲醇)都能(néng)成功表達目的蛋白(bái)。

蛋白(bái) B 表達測試圖（Reduced SDS-PAGE）