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酪蛋白(bái)是牛乳中含量最多的蛋白(bái)質，約占牛奶總蛋白(bái)質的80%。其中，β-酪蛋白(bái)約占酪蛋白(bái)的30%左右。有研究顯示，由于奶牛的雜(zá)交和(hé)基因突變等因素的影響，牛乳中β-酪蛋白(bái)有多達10餘種變異體，其中以A1和(hé)A2爲比較常見的變異體。
A2β-酪蛋白(bái)（A2，β-casein-A2）在消化過程中不會(huì)像A1β-酪蛋白(bái)（A1，β-casein-A1）一樣産生β-酪啡肽-7（BCM-7），而BCM-7可能(néng)與過敏、消化吸收障礙有關。A1和(hé)A2β-酪蛋白(bái)區(qū)别在于第67位氨基酸的不同，這(zhè)種分子結構細微的差别，爲後期分離和(hé)純化帶來(lái)了(le)挑戰，也(yě)是市面上(shàng)還無商業化的A1和(hé)A2蛋白(bái)标準品可供使用(yòng)的重要原因。來(lái)自(zì)乳業生物技術國家重點實驗室的研究人員在實驗研究中，借助大(dà)腸杆菌蛋白(bái)表達系統，通過構建特定β-酪蛋白(bái)變異體表達系統，探索了(le)A1和(hé)A2β-酪蛋白(bái)生物合成的可能(néng)性。這(zhè)也(yě)将幫助科研人員爲後續乳蛋白(bái)定向合成以及相關乳制品的A1和(hé)A2蛋白(bái)定量檢測提供基礎。
通過在Uniprot數據庫中查找β-酪蛋白(bái)有224氨基酸序列（P02666），其中在N端包含15個氨基酸組成的信号肽序列。根據A1和(hé)A2蛋白(bái)在氨基酸組成上(shàng)的差異分别得到(dào)對(duì)應的氨基酸序列設計(jì)相應的堿基序列。根據設計(jì)對(duì)應的堿基序列和(hé)相應的帶Nde I和(hé)Xho I酶切位點的引物進行目的片段的克隆。
通過Prot Param軟件對(duì)A1和(hé)A2蛋白(bái)氨基酸序列進行分析得到(dào)對(duì)應蛋白(bái)質理(lǐ)化性質，A1和(hé)A2蛋白(bái)分子量在25 kDa左右，親疏水(shuǐ)性基本相同。
分别構建含有CSN2-A1和(hé)CSN2-A2目的基因的重組質粒載體pET28a（+）-CSN2-A1和(hé)pET28a（+）-CSN2-A2。将構建的重組表達載體導入到(dào)大(dà)腸杆菌BL21（DE3）中進行誘導表達和(hé)純化。結果表明(míng)，在0.2 mmol/L IPTG，37 ℃下(xià)誘導表達4 h可獲得大(dà)量蛋白(bái)，但(dàn)通過SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白(bái)以包涵體形式表達，存在于細胞破碎後的沉澱中。通過洗滌、溶解、鎳柱親和(hé)色譜純化、複性以及鑒定等步驟最終可獲得純度大(dà)于90%（PAGE）的A1和(hé)A2重組蛋白(bái)。
不同A1/A2重組菌體誘導表達SDS-PAGE考馬斯亮(liàng)藍染色結果
注：M：Marker；1：未誘導；2~6：誘導後不同單克隆菌株
實驗結果表明(míng)A1和(hé)A2包涵體蛋白(bái)經過清洗、複溶和(hé)純化後在25 kDa附近出現(xiàn)目的蛋白(bái)條帶以外(wài)基本無其他(tā)雜(zá)蛋白(bái)，因此達到(dào)了(le)預期純化目标。
A1和(hé)A2重組表達菌株誘導後得到(dào)的沉澱樣、複溶以及純化後樣品SDS-PAGE電泳圖
注：M：Marker；1：破碎後沉澱；2：破碎溶解後上(shàng)清；3：過柱流出液；4：清洗樣；5：洗脫樣
包涵體通過純化後利用(yòng)透析袋進行複性，得到(dào)複性後的重組的A1和(hé)A2蛋白(bái)樣品。SDS-PAGE檢測後呈單一條帶，且純度超過90%。
A1和(hé)A2蛋白(bái)作(zuò)爲β-酪蛋白(bái)兩種常見的變異體類型，由于兩者在分子結構上(shàng)的細微差異使其在用(yòng)常規方法制備和(hé)純化上(shàng)存在困難。這(zhè)項研究最終獲得的A1和(hé)A2重組蛋白(bái)含量分别爲1.5和(hé)2.0 mg/mL，這(zhè)也(yě)爲人工(gōng)合成特定變異體的β-酪蛋白(bái)提供了(le)新的借鑒。
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