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納米抗體之噬菌體文(wén)庫構建過程詳解

發表時(shí)間:2022-10-25 訪問次數:2042

  在羊駝納米抗體制備過程中,除了(le)做好(hǎo)免疫和(hé)提取外(wài),噬菌體文(wén)庫的構建也(yě)是其核心過程之一,隻有做好(hǎo)了(le)這(zhè)個過程,才能(néng)獲得我們所需的抗體庫。那麽,在提取淋巴細胞之後,如何構建噬菌體文(wén)庫呢(ne)?今天普健生物就在這(zhè)裏和(hé)大(dà)家一一介紹。

羊駝納米抗體制備

  對(duì)于不同的公司來(lái)說,納米抗體噬菌體文(wén)庫的構建是各不相同的,不過主要的區(qū)别在一些(xiē)細節流程方面,大(dà)體的制備過程如下(xià):

  1、提取RNA。将我們提取的淋巴細胞溶解後轉移至新的離心管中,加入氯仿後混勻,離心15分鐘(zhōng)後轉至新的離心管中。加入等體積的異丙醇,靜置10分鐘(zhōng)後再次離心10分鐘(zhōng)後,用(yòng)75%的乙醇清晰沉澱,離心5分鐘(zhōng)後去除上(shàng)清液,而後将其溶解質無RNA酶的水(shuǐ)中;

  2、轉錄cRNA。将如上(shàng)所得RNA一分爲二,轉錄成cDNA;

  3、擴增。将轉錄出的cDNA擴增到(dào)特定的抗體片段中;

  4、克隆至噬菌體。将擴增所得的多樣化抗體基因序列和(hé)噬菌體進行酶切,通過純化後進行鏈接反應。而後再将所得DNA純化後回收,并使用(yòng)超純水(shuǐ)進行溶解;

  5、擴增和(hé)純化。将如上(shàng)所得的噬菌體鏈接物進行培養,按照輔助噬菌體數目20:1的比例加入輔助噬菌體後繼續培養30分鐘(zhōng),加入濃度50ug/ml的卡那黴素,30度下(xià)搖床培養。所得培養的菌體離心5分鐘(zhōng)後提取上(shàng)清液,冰敷30分鐘(zhōng)後離心10分鐘(zhōng)并去除緩沖物中的溶解沉澱。再加入nacl後,冰上(shàng)孵育10分鐘(zhōng)後離心15分鐘(zhōng),最終得到(dào)噬菌體庫;

  納米抗體噬菌體文(wén)庫構建的一些(xiē)注意事(shì)項:

  1、噬菌體文(wén)庫容量和(hé)多樣性是衡量文(wén)庫優質與否的重要因素,一般來(lái)說,容量越大(dà)、多樣性越好(hǎo),構建的噬菌體文(wén)庫質量越佳;

  2、在RNA提取的過程中,RNA的降解和(hé)反轉錄過程中模闆、引物及其用(yòng)量,擴增輪數、細菌轉化效率、連接體大(dà)小(xiǎo)等因素我們都需要多注意一下(xià);

  總的來(lái)說,噬菌體文(wén)庫構建成功與否,提取和(hé)擴增過程都是非常重要的,如果這(zhè)幾步的操作(zuò)不成功的話(huà),會(huì)在極大(dà)程度上(shàng)影響到(dào)抗體制備的成功與否。所以,對(duì)于我們來(lái)說,隻有做好(hǎo)這(zhè)幾個方面的工(gōng)作(zuò),才能(néng)在更大(dà)程度上(shàng)促進實驗的完成。普健生物專業爲廣大(dà)用(yòng)戶提供噬菌體文(wén)庫構建服務,如果您有相關需求,歡迎來(lái)電咨詢。