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上(shàng)期推文(wén)《終于有人把主流的單抗開(kāi)發平台總結清楚了(le)?》中，小(xiǎo)編和(hé)大(dà)家介紹了(le)各種高(gāo)效且目前主流的單抗開(kāi)發平台，從(cóng)本篇開(kāi)始，讓我們一起關注這(zhè)些(xiē)更具獨特性的抗體制備方法和(hé)抗體應用(yòng)方向。
泛素和(hé)泛素化
泛素(ubiquitin，Ub)是一種小(xiǎo)分子多肽，由76個氨基酸組成并廣泛分布于真核細胞中。其主要功能(néng)是非底物特異性的标記需要降解的蛋白(bái)質，主要存在形式包括：遊離的泛素、多泛素鏈、泛素化蛋白(bái);不同形式存在的泛素含量反映了(le)細胞的不同生理(lǐ)狀态。
不同類型的泛素化
泛素化是指泛素分子在一系列特殊酶(如泛素激活酶、結合酶、連結酶、降解酶等)的作(zuò)用(yòng)下(xià)，将細胞内的蛋白(bái)質進行分類，篩選出靶蛋白(bái)分子并對(duì)其進行特異性修飾的過程。由于泛素化的多樣性與多價性，泛素化廣泛參與包括細胞增殖、分化、凋亡、自(zì)噬、DNA損傷修複、免疫應答(dá)等各種生理(lǐ)過程，是近年來(lái)生物化學研究的一個重大(dà)成果，已成爲新藥開(kāi)發的主要方向之一。
泛素化的具體過程
泛素化修飾涉及泛素激活酶E1、泛素結合酶E2和(hé)泛素連接酶E3的一系列反應：
在ATP供能(néng)的情況下(xià)E1粘附在泛素分子尾部活化泛素分子生成Ub-E1複合體，E1将激活的泛素分子轉移到(dào)E2酶上(shàng)形成Ub-E2複合體。随後，E2酶和(hé)一些(xiē)種類不同的E3酶共同識别靶蛋白(bái)，對(duì)其進行泛素化修飾。根據E3與靶蛋白(bái)的相對(duì)比例可以将靶蛋白(bái)單泛素化修飾和(hé)多聚泛素化修飾。
泛素化過程(Stone, Sophia L., 2019)
E1：泛素激活酶E1;E2：泛素偶聯酶E2;E3：泛素連接酶E3;
Target：靶蛋白(bái);Ubiquitin：泛素;DUBs：去泛素化酶。
P.S.單個泛素分子以其C-末端賴氨酸與靶蛋白(bái)的一個Lys側鏈相連叫做單泛素化，與多個賴氨酸殘基相連叫做多泛素化。如果靶蛋白(bái)的單個Lys殘基被多個泛素分子标記則稱爲多聚泛素化。
簡而言之，也(yě)就是在E1、E2、E3三類酶的順序催化下(xià)，泛素被以特異性的方式連接到(dào)靶标蛋白(bái)質或靶标蛋白(bái)質上(shàng)已連接的泛素鏈上(shàng)，其中E3泛素化連接酶決定靶蛋白(bái)的特異性識别。蛋白(bái)質泛素化的結果是使得被标記的蛋白(bái)質被蛋白(bái)酶分解爲較小(xiǎo)的多肽、氨基酸以及可以重複使用(yòng)的泛素。
泛素化抗體的應用(yòng)
自(zì)泛素-蛋白(bái)酶體系統在20世紀80年代初被發現(xiàn)以來(lái)，與其相關的研究成果層出不窮。泛素對(duì)細胞的生命活動不可或缺，但(dàn)由于泛素化的複雜(zá)性，人們目前的認知(zhī)也(yě)隻是冰山一角，很(hěn)多問題仍有待研究。泛素化抗體适用(yòng)于檢測不同形式的泛素，以幫助科研人員了(le)解細胞在生命活動中差異顯著的蛋白(bái)質的性質，研究這(zhè)些(xiē)變化的規律，可幫助科研人員準确定位泛素化靶點和(hé)靶向相關疾病的治療。例如，診斷阿爾茨海默病(AD)的神經原纖維纏結和(hé)成對(duì)螺旋絲，帕金(jīn)森病中的路易小(xiǎo)體，以及尼曼-匹克病中的匹克小(xiǎo)體都是高(gāo)度泛素化的，可以很(hěn)容易地用(yòng)泛素抗體檢測到(dào)。
如何檢測蛋白(bái)是否泛素化
1、免疫沉澱反應
通過免疫共沉澱方法分離特定蛋白(bái)質及其結合蛋白(bái)(包括被泛素化修飾的蛋白(bái))。分離出的蛋白(bái)經SDS電泳後用(yòng)泛素抗體進行western blot分析，可以鑒定具體哪個蛋白(bái)發生了(le)泛素化修飾以初步判斷某蛋白(bái)具有泛素化功能(néng)。
2、體外(wài)泛素标記突變位點
将研究蛋白(bái)(被泛素化的蛋白(bái))通過蛋白(bái)提取試劑盒提取内源性蛋白(bái)或通過基因工(gōng)程技術重組表達後提純。用(yòng)k63或k48連接的泛素鏈肽段系列酶E1、E2、E3在适當條件下(xià)體外(wài)孵育，然後用(yòng)泛素抗體進行western blot分析。該方法可以明(míng)确所研究蛋白(bái)的哪個賴氨酸殘基容易發生泛素化。
3、體外(wài)泛素化實驗
将待研究蛋白(bái)A(被泛素化的蛋白(bái))與UBE1，Ubc13和(hé)UBE2V2 complex，Tag-ubiquitin以及待研究的蛋白(bái)B(具有泛素連接酶E3活性)在體外(wài)反應緩沖液中共同進行孵育。将孵育後的産物進行IP和(hé)WB分析。該方法可以明(míng)确B蛋白(bái)具有E3連接酶活性且是引起A蛋白(bái)發生泛素化修飾的關鍵因素。
普健生物除可進行常規的單抗、多抗制備外(wài)，還可定制如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等修飾性抗體，抗體制備經驗豐富，抗體發現(xiàn)平台完善。
