抗體人源化最關鍵的步驟是？

抗體人源化

自(zì)單克隆抗體問世以來(lái)，最常用(yòng)的鼠源性單克隆抗體在臨床診斷及治療等方面發揮了(le)巨大(dà)的作(zuò)用(yòng)，但(dàn)常用(yòng)的鼠源單克隆抗體具有較強的免疫原性，在臨床應用(yòng)中會(huì)引起人抗鼠抗體（HAMA）反應， 導緻抗體半衰期縮短（不到(dào)20 h），治療效果減弱。利用(yòng)DNA重組和(hé)蛋白(bái)質工(gōng)程技術，對(duì)抗體基因進行重組，可在保留鼠源抗體對(duì)抗原有效結合部位的同時(shí)最大(dà)限度地降低(dī)非結合部位的鼠源性，這(zhè)種通過重組基因表達的既有鼠源成分又有人源成分的抗體稱爲人源化抗體，又可稱爲基因工(gōng)程抗體。抗體人源化則成爲了(le)将鼠源性單抗轉化爲安全有效的治療藥物的重要方式。

 

人源化抗體包括嵌合抗體、改型抗體、表面重塑抗體和(hé)全人源化抗體等幾類。

嵌合抗體

由于90%的HAMA是針對(duì)抗體C區(qū)的，設計(jì)從(cóng)分泌鼠單克隆抗體的雜(zá)交瘤細胞基因組中分離功能(néng)性Ig V區(qū)基因，然後與人Ｃ區(qū)基因按一定方式拼接，克隆到(dào)表達載體中并轉入宿主細胞所制備的抗體稱爲嵌合抗體（Chimeric Antibody)。這(zhè)種抗體的Fab區(qū)是鼠源的， Fc區(qū)是人源的。由于整個抗體分子約2/3 部分爲人源的，較好(hǎo)地避免了(le)HAMA反應，延長了(le)抗體在體内的半衰期，改善了(le)抗體藥物動力學。

1984年美(měi)國科學家Morrison等首次将人Ig的C區(qū)基因與鼠單克隆抗體的Ｖ區(qū)基因連接，成功表達人-鼠嵌合抗體以來(lái)，基因工(gōng)程抗體的研究發展迅速。已有多種不同特異性的基因工(gōng)程抗體經FDA批準進入臨床使用(yòng)，顯示了(le)良好(hǎo)的應用(yòng)前景。

改型抗體 

改型抗體也(yě)稱CDR植入抗體(CDR grafting antibody)，抗體可變區(qū)的CDR是抗體識别和(hé)結合抗原的區(qū)域，直接決定抗體的特異性。将鼠源單抗的CDR移植至人源抗體可變區(qū)，替代人源抗體CDR，使人源抗體獲得鼠源單抗的抗原結合特異性，同時(shí)減少其異源性。然而，抗原雖然主要和(hé)抗體的CDR接觸，但(dàn)FR區(qū)也(yě)常參與作(zuò)用(yòng)，影響CDR的空(kōng)間構型。因此換成人源FR區(qū)後，這(zhè)種鼠源CDR和(hé)人源FR相嵌的V區(qū)，可能(néng)會(huì)改變單抗原有的CDR構型，導緻結合抗原的能(néng)力下(xià)降甚至明(míng)顯下(xià)降。雖然目前已能(néng)對(duì)抗體進行分子設計(jì)，在人源FR區(qū)引入鼠源FR區(qū)的某些(xiē)關鍵殘基（如配置得當，其親和(hé)力可與原有小(xiǎo)鼠抗體的親和(hé)力相當），但(dàn)人源化抗體常達不到(dào)原有鼠源單抗的親和(hé)力。

表面重塑抗體

表面重塑抗體是指對(duì)異源抗體表面氨基酸殘基進行人源化改造。該方法的原則是僅替換與人抗體SAR差别明(míng)顯的區(qū)域，在維持抗體活性并兼顧減少異源性基礎上(shàng)選用(yòng)與人抗體表面殘基相似的氨基酸替換；另外(wài)，所替換的區(qū)段不應過多，對(duì)于影響側鏈大(dà)小(xiǎo)、電荷、疏水(shuǐ)性，或可能(néng)形成氫鍵從(cóng)而影響到(dào)抗體互補決定區(qū)（CDR）構象的殘基盡量不替換。

全人源化抗體

全人源化抗體是指通過轉基因或轉染色體技術，将人類編碼抗體的基因全部轉移至基因工(gōng)程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達人類抗體，達到(dào)抗體全人源化的目的。

 

---

當前正處于臨床研究的多種抗體中，嵌合抗體和(hé)人源化抗體所占比例大(dà)于70%。目前的人源化抗體，主要用(yòng)于腫瘤、自(zì)身免疫性疾病和(hé)心血管疾病的治療以及抗移植排斥反應和(hé)抗病毒感染等方面。

---

 

通過完善的蛋白(bái)表達純化平台，穩定細胞系構建平台和(hé)噬菌體展示技術平台，結合經驗豐富的專家團隊（曾經成功研制并且上(shàng)市過治療性抗體藥物），普健生物可提供個性化方案定制，一對(duì)一項目跟進，細緻化實驗報(bào)告等一站(zhàn)式抗體人源化服務，服務内容包括以下(xià)幾個方面：

1

抗體可變區(qū)/抗體全長測序

通過鼠源單克隆抗體細胞系進行抗體可變區(qū)/抗體全長基因序列測序，2-4周。

2

嵌合抗體表達及抗原抗體結合分析

結合可變區(qū)序列及人源恒定區(qū)序列設計(jì)嵌合抗體，通過哺乳系統進行嵌合抗體表達；對(duì)嵌合抗體進行抗原抗體結合分析，同時(shí)可提供樣本給客戶進行親和(hé)力檢測及生物活性檢測，8~10周。

3

人源化抗體設計(jì)

基于CDR移植、回複突變、生物信息學分析等方法對(duì)VH和(hé)VL區(qū)域進行人源化設計(jì)，根據需求提供不同套餐供客戶選擇，2-3周。

敲黑闆！

敲黑闆！

我們知(zhī)道(dào)

抗體人源化改造

的關鍵問題就在于

确定抗體FR區(qū)上(shàng)對(duì)抗體親和(hé)力産生重大(dà)影響的

人源化替換位點，

換句話(huà)說就是定位影響CDR區(qū)構象的關鍵氨基酸。

這(zhè)決定了(le)人源化抗體項目的成敗。

因此，必須高(gāo)度重視(shì)

人源化抗體的設計(jì)。

否則，

很(hěn)可能(néng)

“一失足成千古恨”

"再回頭資金(jīn)已打水(shuǐ)漂"。

也(yě)隻有做好(hǎo)人源化抗體設計(jì)，

以下(xià)的步驟才有意義。

↓

4

人源化抗體表達

密碼子優化，基因合成，亞克隆，轉染，抗體表達及純化，8-10周。

5

人源化抗體性質檢測

結合力檢測：ELISA/FACS測定EC50值，或Biacore/Octet測定Kd值；人源化抗體體外(wài)生物活性分析并與嵌合抗體進行比較；人源化抗體與同源性物種的交叉反應性分析；人源化抗體生物物理(lǐ)特性分析：SEC-HPLC分析，DS-PAGE分析，DSC分析。

普健生物人源化抗體的篩選

基于以下(xià)評估準則：

• 哺乳細胞蛋白(bái)表達系統（HEK293F或CHO）進行瞬時(shí)表達的表達水(shuǐ)平。

• 基于檢測指标EC50（通過ELISA或FACS檢測）或Kd（通過Biacore或Octet檢測），将人源化抗體結合力與嵌合抗體結合力進行對(duì)比。

• 基于體外(wài)生物活性測試，将人源化抗體活性與嵌合抗體活性進行對(duì)比。

• 基于體外(wài)結合試驗，檢測人源化抗體與相關同源物種的交叉反應性。

• 基于生物物理(lǐ)性質分析，将人源化抗體與嵌合抗體進行對(duì)比，主要爲以下(xià)幾點：

      a）通過SEC-HPLC鑒定大(dà)分子聚集程度。

      b）還原性及非還原性SDS-PAGE鑒定。

      c）通過DSC分析檢測Tm值。

更重要的是，

普健生物抗體人源化

方案制定是個性化的，

收費方式是分步的！

最後，

相信随着分子生物學技術的發展，尤其是鼠抗體人源化技術，抗體庫技術、轉基因技術的迅速發展，以及對(duì)疾病機理(lǐ)的不斷深入研究，人源化抗體在臨床應用(yòng)中将會(huì)更加廣泛。