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假如世界上(shàng)真的有唐僧肉，
我絕對(duì)想當妖精。
然而人類長生不老(lǎo)的問題一直懸而未決，
所以，
我們才會(huì)總是問活着的意義。
爲了(le)避諱，
生物學上(shàng)的“死亡”，
不同的社會(huì)學說法就有兩百多種。
還有一種叫做“凋亡”，
是生物體組成基本單位——細胞
的消失方式之一，
它完美(měi)地诠釋了(le)
一種從(cóng)容不迫的态度。
那麽，
什(shén)麽是凋亡呢(ne)？
↓
細胞凋亡（Apoptosis）,又稱程序性細胞死亡（Programmed Cell Death，PCD），是指細胞在一定的生理(lǐ)或病理(lǐ)條件下(xià)，遵循自(zì)身的程序，自(zì)己結束其生命，有一系列酶參與、由基因控制的一個主動的、高(gāo)度有序的、非炎症性細胞死亡的過程。近年來(lái)已在很(hěn)多領域如胚胎學、内分泌學、免疫學，尤其是腫瘤學方面引起廣泛的興趣和(hé)關注，其研究可能(néng)有助于闡明(míng)腫瘤發病機理(lǐ)并爲其治療提供嶄新的途徑。
細胞凋亡不同于細胞壞死：
細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)别
壞死（necrosis）是細胞受到(dào)強烈理(lǐ)化或生物因素作(zuò)用(yòng)引起細胞無序變化的死亡過程，表現(xiàn)爲細胞脹大(dà)、胞膜破裂、細胞内容物外(wài)溢、核變化較慢、DNA降解不充分和(hé)引起嚴重的局部炎症反應等。
凋亡是細胞對(duì)環境的生理(lǐ)性或病理(lǐ)性刺激信号、環境條件的變化或緩和(hé)性損傷産生的應答(dá)有序變化的死亡過程，是一種基本的細胞生物學現(xiàn)象，在多細胞生物中起着去除不需要細胞或異常細胞的作(zuò)用(yòng)。表現(xiàn)爲細胞的體積變小(xiǎo)、變形，細胞膜完整但(dàn)出現(xiàn)發泡現(xiàn)象，細胞凋亡期可見凋亡小(xiǎo)體。貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落等現(xiàn)象。
原來(lái)如此~
那麽小(xiǎo)編不禁想問，
怎麽才能(néng)知(zhī)道(dào)一個細胞是否凋亡呢(ne)？
别擔心，
人類有很(hěn)多種檢測細胞凋亡的方法，
下(xià)面主要介紹兩種：
細胞凋亡的檢測方法
最直觀的當然是“看(kàn)”啦：
1
形态學觀察
光鏡下(xià)細胞凋亡最早變化有細胞體積縮小(xiǎo)、細胞核固縮、染色體邊集在核膜内側、核碎裂、細胞漿和(hé)細胞器密度增高(gāo)，細胞膜皺折、卷曲、出泡、胞漿膜包裹細胞碎片“凋亡小(xiǎo)體”，凋亡小(xiǎo)體是細胞凋亡的特征性改變。
電鏡下(xià)可見在細胞凋亡的早期細胞核染色體發生邊集，在細胞核膜周邊聚集成新月體形，随之染色體發生固縮、電子密度增強、核形不規整，核碎裂成碎片、細胞體積變小(xiǎo)、胞漿濃縮、空(kōng)泡增多，可見細胞膜丫生出泡現(xiàn)象；在凋亡晚期可見膜泡内有較完整的細胞器和(hé)細胞核碎片的凋亡小(xiǎo)體。
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凋亡小(xiǎo)體的形成示意
除了(le)宏觀上(shàng)的定性觀察，
還有更精确的定量檢測。
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2
生化特征檢測
細胞凋亡最明(míng)顯的生化特征是Ca2 + 、Mg2+ 依賴性内源性核酸酶的激活将細胞核染色體從(cóng)核小(xiǎo)體間斷裂，形成由大(dà)約爲180 - 200bp 或其多聚體組成的寡核苷酸片段。
DNA凝膠電泳法
DNA 凝膠電泳表現(xiàn)在：正常活細胞 DNA電泳爲一條區(qū)帶,細胞凋亡時(shí)核酸内切酶将DNA 分解成規則的180-200bp的DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳中就呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜，而壞死呈彌漫的連續圖譜。DNA 電泳法的缺點是不能(néng)進行準确定量，隻能(néng)進行半定量。其靈敏性較差，要求所測标本細胞數在106 以上(shàng)才能(néng)使電泳清晰。實驗流程如下(xià)：收集細胞（5×106-107個cell ）→ DNA 提取（酚氯仿、氯仿抽提）→瓊脂糖凝膠電泳→結果分析。
TUNEL法
TUNEL法（terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling,末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端标記測定法)也(yě)稱DNA 斷裂的原位末端标記法，這(zhè)一方法能(néng)對(duì)DNA分子斷裂缺口中的3'-OH進行原位标記，借助一種可觀測的标記物(如熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物)，能(néng)對(duì)凋亡細胞的核DNA中産生的3'-OH末端進行原位标記，用(yòng)熒光顯微鏡即可進行觀察。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有 DNA 的斷裂，因而沒有 3'-OH 形成，很(hěn)少能(néng)夠被染色。TUNEL 實際上(shàng)是分子生物學與形态學相結合的研究方法，對(duì)完整的單個凋亡細胞核或凋亡小(xiǎo)體進行原位染色，能(néng)準确地反應細胞凋亡典型的生物化學和(hé)形态特征，可用(yòng)于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和(hé)從(cóng)組織中分離的細胞的細胞形态測定。
Annexin V法
磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于細胞膜的内側，但(dàn)在細胞凋亡的早期，PS可從(cóng)細胞膜的内側翻轉到(dào)細胞膜的表面，暴露在細胞外(wài)環境中。Annexin-V是一種分子量爲35~36kD 的Ca2 +依賴性磷脂結合蛋白(bái)，能(néng)與PS高(gāo)親和(hé)力特異性結合。将 Annexin-V 進 行 熒 光 素（FITC、PE）标 記，以标記了(le)的Annexin-V 作(zuò)爲熒光探針，利用(yòng)流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶(propidine iodide ，PI)是一種核酸染料，它不能(néng)透過完整的細胞膜，但(dàn)在凋亡中晚期的細胞和(hé)死細胞，PI能(néng)夠透過細胞膜而使細胞核紅(hóng)染。因此将Annexin-V與PI匹配使用(yòng)，就可以将凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。實驗流程如下(xià)：收集細胞（5×105~106 ）→ 細胞染色（Annexin V，FITC 凋亡檢測試劑盒）→流式細胞儀上(shàng)機檢測→專業流式軟件結果分析（如flowjo ）。
Caspase-3活性檢測法
Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起着非常重要的作(zuò)用(yòng)，其中caspase-3爲關鍵的執行分子，它在凋亡信号傳導的許多途徑中發揮功能(néng)。Caspase-3正常以酶原（32 kD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大(dà)亞基（17 kD）和(hé)兩個小(xiǎo)亞基（12 kD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導緻細胞凋亡。但(dàn)在細胞凋亡的晚期和(hé)死亡細胞中，caspase-3的活性明(míng)顯下(xià)降。實驗流程：（以Western blot 分析爲例）收集細胞→PBS洗滌→蛋白(bái)提取→蛋白(bái)定量→SDS-PAG電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉移→5%脫脂奶粉封閉→一抗孵育（Caspase-3多抗或單抗）→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗滌→二抗孵育→ TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗滌→ECL顯影或NBT/BCIP顯色→結果分析及判定。
幫人幫到(dào)底，送佛送到(dào)西。
除了(le)告訴你(nǐ)怎麽做，我們還會(huì)指點你(nǐ)怎麽辦~
且看(kàn)
常見問題
解決方案
1
如何選擇合适的凋亡檢測方法?
定性的研究方法可選DNA電泳法、形态學觀察（普通光學顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡）；定量或半定量的研究方法可選各種流式細胞儀方法、原位末端标記法等。DNA瓊脂糖凝膠電泳法敏感性不高(gāo)，大(dà)量凋亡細胞同時(shí)存在時(shí)才出現(xiàn)典型的結果，且隻能(néng)用(yòng)于細胞群體，不能(néng)用(yòng)于組織的原位檢測；TUNEL法可用(yòng)于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和(hé)從(cóng)組織中分離的細胞的細胞形态測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用(yòng)；細胞發生凋亡時(shí)，膜上(shàng)的PS外(wài)露早于DNA斷裂發生，因此Annexin V聯合PI染色法檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更爲靈敏。并且Annexin V聯合PI染色不需固定細胞，可避免PI染色因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA片段丢失。因此，Annexin V聯合PI法更加省時(shí)，結果更爲可靠，是目前最爲理(lǐ)想的檢測細胞凋亡的方法。
2
Annexin V法通過流式細胞儀檢測細胞凋亡時(shí)
沒有凋亡信号/沒有早期凋亡信号？
沒有檢測到(dào)凋亡信号說明(míng)細胞未被染料标記上(shàng)。不同公司生産的Annexin V、FITC細胞凋亡檢測試劑盒的生産工(gōng)藝流程都不一樣。首先檢查試劑盒儲存是否正确（4度還是-20度）以及保質期；其次檢查是否嚴格按照試劑盒所提供的實驗說明(míng)進行操作(zuò)。
3
Annexin V法通過流式細胞儀檢測細胞凋亡時(shí)
凋亡信号值過高(gāo)？
在實驗操作(zuò)過程中應動作(zuò)輕柔、迅速，避免影響細胞的活力及形态。在處理(lǐ)貼壁細胞時(shí)應使用(yòng)不含EDTA的胰蛋白(bái)酶消化細胞，消化時(shí)間不宜太長，染色操作(zuò)完成時(shí)應盡快(kuài)上(shàng)機檢測。
