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大(dà)腸杆菌表達系統
雖然目前應用(yòng)最爲廣泛，
但(dàn)在需要可溶性蛋白(bái)時(shí)，
得到(dào)的卻有可能(néng)是包涵體。
或許，
我們可以先了(le)解一下(xià)包涵體到(dào)底是啥
↓
包涵體(Inclusion Body)是外(wài)源基因在原核細胞中表達時(shí)，尤其是在大(dà)腸杆菌中高(gāo)效表達時(shí)，形成的由膜包裹的高(gāo)密度（1.3 mg/ml）不溶性蛋白(bái)質顆粒，在顯微鏡下(xià)觀察時(shí)爲高(gāo)折射區(qū)，與胞質中其他(tā)成分有明(míng)顯區(qū)别。
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包涵體示意圖
包涵體一般含有50%以上(shàng)的重組蛋白(bái)，其餘爲核糖體元件、RNA聚合酶、内毒素、外(wài)膜蛋白(bái)以及脂體、脂多糖等，隻溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。
包涵體大(dà)小(xiǎo)爲0.5-1 um左右，大(dà)腸杆菌細胞質中的包涵體直徑一般在0.2 μm到(dào)1.5 μm之間。不同的蛋白(bái)質具有不同的直徑，如幹擾素的大(dà)小(xiǎo)是0.811 μm，而牛凝乳酶原的大(dà)小(xiǎo)是1.281 μm。在一些(xiē)情況下(xià)，有些(xiē)包涵體比較大(dà)，直徑大(dà)于大(dà)腸杆菌的直徑，使得大(dà)腸杆菌有一個突起。大(dà)的包涵體可以利用(yòng)光學顯微鏡看(kàn)到(dào)。一般情況下(xià)，一個細胞僅有一個包涵體。包涵體從(cóng)來(lái)不吸附在膜上(shàng)，并且不同于真核細胞中的其他(tā)細胞器。高(gāo)精度的投射電子顯微鏡顯示了(le)低(dī)分子量包涵體的多孔結構。
還有一種叫做
↓病毒包涵體
病毒在增殖的過程中，常使寄主細胞形成一種蛋白(bái)質性質的病變結構，在光學顯微鏡下(xià)可見，多爲圓形、卵圓形或不定形。一般是由完整的病毒顆粒或尚未裝配的病毒亞基聚集而成，少數則是宿主細胞對(duì)病毒感染的反應産物，不含病毒粒子。有的位于細胞質中（如天花(huā)病毒包涵體），有的位于細胞核中（如疱疹病毒），或細胞質、細胞核中都有（如麻疹病毒）。有的還具有特殊名稱，如天花(huā)病毒包涵體叫顧氏（Guarnieri）小(xiǎo)體，狂犬病毒包涵體叫内基氏（Negri）小(xiǎo)體。細胞中的生物學活性蛋白(bái)質常以可溶性或分子複合物的形式存在，功能(néng)性的蛋白(bái)質總是折疊成特定的三維結構型。而包涵體内的蛋白(bái)是非折疊狀态的聚集體，因此不具有生物學活性。
↑
這(zhè)也(yě)是包涵體讓人頭疼的原因。
那麽，
它是怎樣形成的呢(ne)？
↓ 包涵體形成的原因
包涵體之所以形成可能(néng)與重組蛋白(bái)在表達過程中缺乏某些(xiē)折疊輔助因子或環境不适無法形成正确的次級鍵有關。
01表達量過高(gāo)
研究發現(xiàn)在低(dī)表達時(shí)很(hěn)少形成包涵體，表達量越高(gāo)越容易形成包涵體。可能(néng)是合成速度太快(kuài)以至于沒有足夠的時(shí)間進行蛋白(bái)折疊，二硫鍵不能(néng)正确配對(duì)，過多蛋白(bái)間的非特異性結合，蛋白(bái)質無法達到(dào)足夠的溶解度等。
02氨基酸組成
一般含半胱氨酸越多的重組蛋白(bái)越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明(míng)顯與包涵體的形成呈正相關。
03所處的環境
發酵溫度高(gāo)或胞内pH接近蛋白(bái)的等電點時(shí)容易形成包涵體。
04蛋白(bái)的來(lái)源
重組蛋白(bái)是大(dà)腸杆菌的異源蛋白(bái)，由于缺乏真核生物蛋白(bái)翻譯後修飾所需酶類，緻使中間體大(dà)量積累，容易形成包涵體沉澱。因此有人采用(yòng)共表達分子伴侶的方法以增加可溶蛋白(bái)的比例。
05包涵體形成的位置
蛋白(bái)包涵體是一個廣泛存在的現(xiàn)象，在大(dà)腸杆菌中，包涵體可在細胞的兩個位置出現(xiàn)：細胞質和(hé)外(wài)周胞質。通常認爲蛋白(bái)的聚集無論出現(xiàn)在細胞内還是細胞外(wài)，都是由于中間體不能(néng)完成折疊導緻的。
包涵體在細胞内形成的位置和(hé)特點
取決于蛋白(bái)表達的方式。
當大(dà)量表達時(shí)，三種不同的（天然的、含有OmpA信号肽的和(hé)完全切除天然信号肽的）内酰氨酶都形成了(le)包涵體，但(dàn)前兩者的包涵體在外(wài)周胞質，後者卻在細胞質内。這(zhè)些(xiē)包涵體的大(dà)小(xiǎo)和(hé)形狀有相當清楚的差别，這(zhè)些(xiē)差别表現(xiàn)在包涵體的表面形态、組成和(hé)多肽鏈構象上(shàng)。
包涵體的純化
包涵體的純化主要有以下(xià)幾個步驟：
1
收菌破碎
細菌發酵液高(gāo)速離心收集菌體，經超聲破碎或者裂解液處理(lǐ)後，高(gāo)速離心收集沉澱。
2洗滌
用(yòng)低(dī)濃度的變性劑如2 M尿素在50 mM Tris ，pH 7.5條件下(xià)洗滌包涵體，除去包涵體上(shàng)粘附的雜(zá)質，此外(wài)可以用(yòng)溫和(hé)去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和(hé)膜蛋白(bái)。該步驟一定要作(zuò)用(yòng)溫和(hé)，過高(gāo)濃度的尿素或鹽酸胍會(huì)使包涵體溶解而無法粗純将雜(zá)質分離。
3
變性溶解
一般用(yòng)強的變性劑如尿素、鹽酸胍，通過離子間的相互作(zuò)用(yòng)，打斷包涵體蛋白(bái)分子内和(hé)分子間的各種化學鍵，使多肽伸展。通常而言鹽酸胍優于尿素，兩者比較如下(xià)所示：
優點
尿素（8 M-10 M）：尿素溶解不電離，呈中性，成本低(dī)，蛋白(bái)複性後除去不會(huì)造成大(dà)量蛋白(bái)沉澱；溶解後的包涵體可選用(yòng)多種色譜方法純化。
鹽酸胍（6 M-8 M）：溶解能(néng)力強，高(gāo)達95%以上(shàng)，溶解作(zuò)用(yòng)快(kuài)而不造成重組蛋白(bái)的共價修飾。
缺點
尿素（8M-10M）：較鹽酸胍慢而弱，溶解度爲70%-90%。
鹽酸胍（6M-8M）：成本高(gāo)，酸性條件下(xià)易形成沉澱，複性後除去可能(néng)造成蛋白(bái)大(dà)量沉澱；對(duì)蛋白(bái)離子交換色譜有幹擾。
包涵體的複性
由于包涵體中的重組蛋白(bái)缺乏生物學活性，加上(shàng)劇(jù)烈的處理(lǐ)條件，使蛋白(bái)的高(gāo)級結構破壞，因此重組蛋白(bái)的複性特别重要。通過緩慢去除變性劑使目标蛋白(bái)從(cóng)變性的完全伸展狀态恢複到(dào)正常的折疊結構，同時(shí)去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時(shí)複性過程開(kāi)始，到(dào)2M左右時(shí)結束。對(duì)于鹽酸胍而言，可以從(cóng)4M開(kāi)始，到(dào)1.5M 時(shí)複性過程結束。
複性是一個非常複雜(zá)的過程，除與蛋白(bái)複性的過程控制相關外(wài)，還很(hěn)大(dà)程度上(shàng)與蛋白(bái)本身的性質有關：有些(xiē)蛋白(bái)非常容易複性，如牛胰RNA酶有12對(duì)二硫鍵，在較寬松的條件下(xià)複性效率可以達到(dào)95%以上(shàng)，而有一些(xiē)蛋白(bái)至今沒有發現(xiàn)能(néng)夠對(duì)其進行複性的方法，如IL-11。很(hěn)多蛋白(bái)的複性效率隻有百分之零點幾。一般來(lái)說，蛋白(bái)質的複性效率在20%左右。影響複性效率的因素有蛋白(bái)質的複性濃度，變性劑的起始濃度和(hé)去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢、離子強度、共溶劑和(hé)其他(tā)添加劑的存在與否等。常用(yòng)的複性方法有以下(xià)幾種。
稀釋複性
用(yòng)複性緩沖液快(kuài)速稀釋溶解的包涵體蛋白(bái)溶液，降低(dī)變性劑濃度簡單地使去折疊的蛋白(bái)進行再折疊。優點：操作(zuò)簡單。
缺點：慢，體積增加很(hěn)大(dà)，變性劑稀釋速度太快(kuài)不易控制，蛋白(bái)會(huì)被稀釋到(dào)很(hěn)低(dī)濃度。
透析複性
通過逐漸降低(dī)外(wài)透液濃度來(lái)控制變性劑的去除速度達到(dào)使包涵體複性的目的。
優點：操作(zuò)簡單，不增加體積。
缺點：慢，使用(yòng)大(dà)量的緩沖液，不适合大(dà)規模大(dà)批量的複性操作(zuò)。
凝膠過濾層析
利用(yòng)分子篩效應将蛋白(bái)質和(hé)小(xiǎo)分子變性劑分離，實現(xiàn)溶液交換和(hé)蛋白(bái)質的再折疊。優點：一步操作(zuò)，直接自(zì)動化完成蛋白(bái)複性和(hé)純化，簡單快(kuài)捷。
缺點：樣品體積受限制，若複性失敗則預裝柱會(huì)被堵死廢棄。
離子交換層析
減少導緻蛋白(bái)聚集的分子間相互作(zuò)用(yòng)，将蛋白(bái)質結合在分離介質上(shàng)從(cóng)而達到(dào)使溶液中變性劑濃度稀釋和(hé)蛋白(bái)質純化的目的。
優點：快(kuài)速并簡單，直接進行，操作(zuò)自(zì)動化。
缺點：操作(zuò)應避免使用(yòng)與離子交換相反電荷的物質。
複性效率的檢測
根據具體的蛋白(bái)性質和(hé)需要，可以從(cóng)生化、免疫、物理(lǐ)性質等方面對(duì)蛋白(bái)質的複性效率進行檢測。主要的檢測方法有以下(xià)幾種：
01凝膠電泳
一般用(yòng)非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可檢測變性和(hé)天然狀态的蛋白(bái)質，或用(yòng)非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白(bái)複性後二硫鍵的配對(duì)情況。
02光譜學方法
可以用(yòng)紫外(wài)差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用(yòng)兩種狀态下(xià)的光譜學特征進行複性情況的檢測，但(dàn)一般隻用(yòng)于複性研究中的過程檢測。
03色譜方法
如IEX、RP-HPLC、CE等，因爲兩種狀态的蛋白(bái)色譜行爲不同。
04生物學活性及比活測定
一般用(yòng)細胞方法或生化方法進行測定，較好(hǎo)地反映了(le)複性蛋白(bái)的活性。值得注意的是，不同的測活方法測得的結果不同，而且常常不能(néng)完全反映體内活性。
05黏度和(hé)濁度測定
複性後的蛋白(bái)溶解度增加，變性狀态時(shí)由于疏水(shuǐ)殘基暴露，一般水(shuǐ)溶性很(hěn)差，大(dà)多形成可見的沉澱析出。
06免疫學方法
如ELISA、Western等，特别是對(duì)結構決定簇的抗體檢驗，比較真實地反映了(le)蛋白(bái)質的折疊狀态。
雖然我們都不怎麽喜歡包涵體，
但(dàn)它也(yě)不是一無是處
↓ 包涵體也(yě)有優越性
在下(xià)遊生産過程中特别是在醫(yī)藥生産中，以包涵體形式表達的蛋白(bái)具有一些(xiē)優越性。
01 異源表達的蛋白(bái)很(hěn)容易被宿主細胞内的蛋白(bái)酶降解，如果以包涵體形式表達，由于酶攻擊的位點被包埋了(le)，可最大(dà)限度地抵抗蛋白(bái)酶的攻擊。
02 由于包涵體表達的蛋白(bái)沒有活性，細胞破碎和(hé)後續的純化步驟不用(yòng)考慮蛋白(bái)的失活問題。
03 包涵體蛋白(bái)與宿主細胞其他(tā)蛋白(bái)的分離比可溶蛋白(bái)的分離方法簡便且造價低(dī)，使用(yòng)簡單的離心或過濾的手段就能(néng)使包涵體與宿主細胞的其他(tā)蛋白(bái)成分有效分離。
04 有些(xiē)外(wài)源蛋白(bái)對(duì)細胞有毒或能(néng)緻死，大(dà)量表達會(huì)導緻細胞死亡，使最終的細胞數量和(hé)産物相當低(dī)，而包涵體形式的蛋白(bái)質由于喪失了(le)生物活性從(cóng)而可以高(gāo)效大(dà)量地表達。
05 對(duì)于以包涵體形式表達的産物比較容易進行在線觀測定性，含有包涵體蛋白(bái)質的細胞有較大(dà)的折射率，不必像可溶的蛋白(bái)質需要細胞破碎後使用(yòng)酶學或者電泳學的方法進行鑒定。 最後
Renaturation is an art form and no standard protocol exists。
相信随着結構生物學、生物信息學、蛋白(bái)質工(gōng)程學及相關新技術和(hé)新設備的發展和(hé)完善，在不久的将來(lái)，預測和(hé)設計(jì)最佳複性方案将成爲可能(néng)。
