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近年來(lái)，人類在治療埃博拉病毒感染的病人時(shí)發現(xiàn)，抗埃博拉病毒的單克隆抗體在治療的過程中起着關鍵作(zuò)用(yòng)。科學家認爲，快(kuài)速有效地開(kāi)發具有生物反應活性的單克隆抗體的技術對(duì)于治療和(hé)控制人類面臨的各類傳染性疾病至關重要。
上(shàng)個世紀90年代，人們就已經開(kāi)始利用(yòng)DNA免疫技術開(kāi)發新型疫苗。DNA疫苗的基本原理(lǐ)：肌肉注射人工(gōng)合成包含有病毒DNA的質粒載體，質粒在體内進行基因表達并合成對(duì)應的蛋白(bái)抗原，從(cóng)而引起機體的免疫反應。這(zhè)種疫苗最顯著的特點是通過内源抗原提呈途徑刺激T細胞産生免疫應答(dá)。然而，在實際應用(yòng)中，基于該原理(lǐ)開(kāi)發的DNA疫苗卻遇到(dào)了(le)問題，例如如何選擇合适的免疫途徑和(hé)免疫佐劑。早期臨床研究數據表明(míng)，通過DNA疫苗免疫的患者血清效價較低(dī)，表明(míng)該方法沒有很(hěn)好(hǎo)的免疫效果。
近期人們對(duì)DNA疫苗的改進主要在以下(xià)2個方面：（1）采用(yòng)更加高(gāo)效的免疫途徑—利用(yòng)基因槍和(hé)電穿孔技術将DNA質粒導入到(dào)機體細胞内，免疫效果得到(dào)顯著提升。（2）混合免疫沖擊。首先用(yòng)DNA質粒進行免疫，然後利用(yòng)重組蛋白(bái)、滅活的病毒或者減毒活疫苗沖擊，這(zhè)種方法比常規的免疫沖擊采用(yòng)同種抗原的效果要好(hǎo)很(hěn)多。總體而言，在小(xiǎo)型動物進行基因免疫的效果要優于大(dà)型動物。這(zhè)一特點也(yě)預示着可以采用(yòng)此方法開(kāi)發高(gāo)質量的小(xiǎo)鼠單克隆抗體。考慮到(dào)DNA免疫誘導這(zhè)種應答(dá)的獨特優勢，早期的研究主要集中在T細胞免疫應答(dá)上(shàng)。很(hěn)少有人關注DNA免疫誘導B細胞免疫應答(dá)的在實際應用(yòng)中的價值。事(shì)實上(shàng)，誘導B細胞産生免疫應答(dá)更加适合開(kāi)發高(gāo)質量的功能(néng)性的單克隆抗體。
Meredith Hazen, Sunil Bhakta等用(yòng)DNA免疫開(kāi)發了(le)一個抗多次跨膜蛋白(bái)（multi-drug resistant protein 4，MRP4）的單克隆抗體，MPR4是12次跨膜蛋白(bái), 與腫瘤的多藥耐藥性的産生有關。腫瘤多藥耐藥性的産生對(duì)癌症的治療是一個很(hěn)大(dà)的挑戰。以下(xià)爲單克隆抗體的檢測數據：
圖1 anti MRP4抗體的檢測結果
01插入抗原序列的設計(jì)及優化
DNA疫苗是用(yòng)哺乳動物表達載體構建的。表達載體的選擇與設計(jì)的免疫原插入序列對(duì)抗體的功能(néng)有非常重要的影響。經典的抗體開(kāi)發流程，往往需要表達重組蛋白(bái)。針對(duì)某些(xiē)蛋白(bái)，特别是多次跨膜的GPCR蛋白(bái)和(hé)離子通道(dào)蛋白(bái)，全長表達非常困難，蛋白(bái)序列和(hé)結構的完整性對(duì)開(kāi)發功能(néng)性抗體是非常關鍵的。無論是天然蛋白(bái)提取純化還是重組蛋白(bái)的表達純化，在操作(zuò)處理(lǐ)過程中，蛋白(bái)的空(kōng)間結構極有可能(néng)會(huì)發生改變。通過基因免疫産生的抗體能(néng)識别蛋白(bái)構象表位的概率要大(dà)很(hěn)多。主要原因在于外(wài)源基因可以在體内直接表達合成具有天然構象的全長蛋白(bái)，從(cóng)而引起對(duì)應的免疫應答(dá)。
DNA疫苗對(duì)于抗原序列的選擇有獨特的優勢。大(dà)部分情況下(xià)，會(huì)選擇表達全長蛋白(bái)序列，特别是多次跨膜蛋白(bái)，都有非常好(hǎo)的效果。而針對(duì)胞内表達的蛋白(bái)，設計(jì)者如果想改變蛋白(bái)表達的定位，可以人爲的設計(jì)不同的信号肽，将胞内蛋白(bái)通過不同的信号肽的作(zuò)用(yòng)變成分泌表達蛋白(bái)，這(zhè)樣可以增強免疫效果。同樣，對(duì)于一次跨膜蛋白(bái)，我們可以設計(jì)隻針對(duì)胞外(wài)區(qū)的抗原序列，這(zhè)樣産生的抗體就是隻識别胞外(wài)區(qū)的表位。開(kāi)發針對(duì)細菌毒素的抗體，可以選擇設計(jì)細菌毒素的某個片段序列，而不是全長，從(cóng)而避免動物免疫過程中出現(xiàn)意外(wài)情況。
DNA疫苗的另外(wài)一個優勢就是可以用(yòng)相同的載體質粒構建過表達細胞株作(zuò)爲單克隆抗體的篩選材料，從(cóng)而省略了(le)蛋白(bái)表達純化的步驟。根據不同蛋白(bái)的宿主來(lái)源，可以選擇不同的篩選策略，詳情見表2。基于過表達細胞株的篩選方法已經被應用(yòng)于開(kāi)發抗跨膜蛋白(bái)、病毒衣殼蛋白(bái)和(hé)胞内蛋白(bái)的單克隆抗體篩選中。在上(shàng)述案例中，可以采用(yòng)FACS，全細胞elisa或者IHC篩選替代傳統的重組蛋白(bái)間接elisa篩選。還有的研究人員采用(yòng)一種新型的in-cell Western的方法篩選針對(duì)胞内表達、膜表達或者核表達的蛋白(bái)抗體。
表1：開(kāi)發單克隆抗體中使用(yòng)的DNA疫苗的抗原序列來(lái)源
表2：單克隆抗體的篩選方法
02表達載體的選擇
DNA疫苗載體的啓動子序列是非常關鍵的調控元件。有研究通過比較CMV和(hé)human ubiquitin C promoter兩種啓動子對(duì)于免疫效果的影響，發現(xiàn)這(zhè)兩種啓動子都能(néng)最終獲得具有生物反應活性的高(gāo)特異性的單克隆抗體，但(dàn)是human ubiquitin C promoter這(zhè)個啓動子隻需要一次尾靜脈注射免疫就能(néng)使小(xiǎo)鼠在七周之内維持非常高(gāo)的血清效價。相對(duì)于常用(yòng)的CMV啓動子，還有一種高(gāo)效的哺乳動物細胞表達的啓動子--CAG(CMV/actin/Globin)，也(yě)能(néng)顯著的增強免疫效果。
03表達載體的選擇
免疫方法大(dà)緻分爲2類：第一種方法是将人工(gōng)合成DNA質粒進行注射免疫，在注射緩沖液中通過加入脂質體或者納米粒子可以增強免疫效果。第二種方法是基于物理(lǐ)外(wài)力作(zuò)用(yòng)的基因槍技術和(hé)電穿孔技術。基因槍技術是将DNA質粒跟金(jīn)納米粒子結合在一起後，再借助高(gāo)壓氣流将納米粒子高(gāo)速射入組織細胞内部。電穿孔技術首先是将DNA疫苗注射進入體内，然後在注射位置施加電流。總體而言，基因槍和(hé)電穿孔的免疫方法比注射免疫的方法引起動物産生免疫反應的效果要好(hǎo)很(hěn)多，同時(shí)更加節省實驗材料。另外(wài)還有尾靜脈注射免疫和(hé)脾髒免疫，均能(néng)誘導動物産生對(duì)應的抗體。免疫時(shí)間間隔一般1周免疫一次，第四次免疫之後就可以檢測血清免疫效果。具體免疫方法和(hé)蛋白(bái)結構分類如下(xià)表：
圖2：小(xiǎo)鼠尾靜脈注射免疫操作(zuò)流程
04免疫佐劑
在最開(kāi)始研究人類DNA疫苗的時(shí)候，由于免疫效果較差，人們開(kāi)始尋找合适的免疫佐劑以增強免疫效果。有文(wén)獻報(bào)道(dào)，腸杆菌伴侶蛋白(bái)Escherichia coli chaperone protein (GroEL) 被證實可以作(zuò)爲一種DNA免疫的分子佐劑。在開(kāi)發針對(duì)GPCR的抗體過程中可以增強免疫應答(dá)。FLT3(fetal liver tyrosine kinase 3 ligand)和(hé)GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)也(yě)可以作(zuò)爲一種免疫佐劑，在增強免疫效果的同時(shí)，還能(néng)誘導産生識别天然蛋白(bái)的胞外(wài)區(qū)序列的抗體。
05DNA免疫-蛋白(bái)沖擊
有一種DNA免疫-蛋白(bái)沖擊的混合免疫方法，可以誘導産生高(gāo)效價和(hé)高(gāo)親和(hé)力抗體。這(zhè)種方法前面采用(yòng)常規的DNA免疫，最後一次免疫沖擊采用(yòng)重組蛋白(bái)，多肽或者滅活的病毒疫苗。
傳統的雜(zá)交瘤細胞融合開(kāi)發抗體的方法在取脾髒融合之前需要進行免疫沖擊，以獲得有足夠多的能(néng)産生目的抗體的B細胞。基因免疫的方式也(yě)同樣需要進行沖擊，一般采用(yòng)靜脈注射或者腹腔注射的方法，在融合之前的3-5天進行。有研究表明(míng)，如果采用(yòng)DNA免疫的方法在細胞融合之前沒有進行沖擊，總體的融合率，抗體的親和(hé)力都會(huì)比較低(dī)，同時(shí)大(dà)部分得到(dào)的抗體都是IgM的亞型。
DNA免疫開(kāi)發高(gāo)質量的單克隆抗體有着以下(xià)獨特的優勢：
（1）可以高(gāo)效地測試不同的抗原序列的免疫效果；
（2）不需要表達或者純化抗原。特别是針對(duì)某些(xiē)緻病類抗原，從(cóng)而避免了(le)生物安全性的問題。
（3）針對(duì)某些(xiē)突發的傳染性疾病，一旦基因序列被确認，就可以快(kuài)速開(kāi)發對(duì)應的抗體。
（4）可以開(kāi)發針對(duì)構象表位的抗體；
（5）可選擇的免疫宿主廣泛，包括小(xiǎo)鼠、兔子和(hé)人。
普健生物目前正在進行基因免疫開(kāi)發單克隆抗體的測試，主要是針對(duì)PDL1，PD1以及一些(xiē)膜蛋白(bái)的項目，目前已有項目正在進行亞克隆，歡迎有需要的客戶咨詢。
另外(wài)，應廣大(dà)客戶要求，本實驗室提供以下(xià)單克隆抗體開(kāi)發相關的關鍵試劑，質量有保障，歡迎大(dà)家選購：
| 特點 | |
|---|---|
| 單組分TMB | 不需要A/B液，反應快(kuài)，5min之内出結果。 |
| 雜(zá)交瘤細胞株sp2/0 |
融合率高(gāo)， 1次融合穩定在4000個融合克隆以上(shàng)，最高(gāo)融合克隆數可達10000以上(shàng)，融合闆及亞克隆7-10天即可進行ELISA篩選；融合細胞不需要飼養細胞。 |
|
羊抗鼠二抗 |
質量穩定，效價高(gāo)。 |
參考文(wén)獻：
1 Shuying Liu,Shixia Wang,Shan Lu et al.DNA immunization as a technology platform for monoclonal antibody induction. Emerging Microbes and Infections 2016(5), e33;
2 Meredith Hazen,Sunil Bhakta et al.An improved and robust DNA immunization method to develop antibodies against extra-cellular loops of multi-transmembrane proteins. mabs 2014;6:1, 95–107.
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