一文(wén)搞定CHO穩轉細胞株構建_亞聯美華（武漢）生物科技有限責任公司

随着生物技術的迅猛發展,全球化資源整合爲生物制藥行業提供了(le)越來(lái)越全面的技術支撐,抗體藥物的發展也(yě)獲得越來(lái)越多的重視(shì)。抗體藥物開(kāi)發是一個非常繁雜(zá)的過程,而穩定細胞株适用(yòng)于抗體藥開(kāi)發的各個階段,如重組蛋白(bái)和(hé)抗體生産、檢測分析、功能(néng)性研究等等。構建适用(yòng)于工(gōng)業生産的高(gāo)表達細胞株是第一步也(yě)是關鍵步驟之一。

普健生物在重組蛋白(bái)表達、抗體生産及穩轉細胞株構建等方面有着10餘年經驗。今天小(xiǎo)普與大(dà)家分享一種基于CHO細胞株構建的高(gāo)效抗體藥開(kāi)發策略,能(néng)顯著提高(gāo)細胞株開(kāi)發效率,實現(xiàn)高(gāo)效、穩定的細胞株開(kāi)發。

CHO表達系統

哺乳動物細胞是用(yòng)于生産單抗在内的商業化治療性蛋白(bái)産品的主要宿主細胞。中國倉鼠卵巢(CHO)細胞是生産蛋白(bái)類藥物的首選宿主細胞,因爲與其他(tā)系統相比,CHO細胞具有以下(xià)優點：

①CHO 細胞對(duì)蛋白(bái)有準确的加工(gōng)、修飾功能(néng),因此其表達的蛋白(bái)質的生物學活性更接近于天然蛋白(bái)；

②CHO 細胞耐受剪切力和(hé)滲透壓的能(néng)力相對(duì)較強,可根據培養要求選擇貼壁培養或懸浮培養的方式；

③整合外(wài)源基因後的細胞穩定,重組基因能(néng)高(gāo)效擴增和(hé)表達；

④表達目的蛋白(bái)可由細胞内運輸到(dào)細胞外(wài),并且CHO 細胞隻表達少量的内源蛋白(bái),有利于目的蛋白(bái)的提取。

GS篩選系統原理(lǐ)

哺乳動物細胞的培養生長過程需要谷氨酰胺（L-glutamine），谷氨酰胺合成酶（GS)将谷氨酸和(hé)氨轉化爲谷氨酰胺，哺乳動物細胞通過這(zhè)一酶促反應獲得谷氨酰胺。

CHO細胞内源的谷氨酰胺合成酶活性比較低(dī),需要在培養基中額外(wài)添加外(wài)源谷氨酰胺才能(néng)促進細胞生長。利用(yòng)GS抑制劑,L-氨基亞砜蛋氨酸(Methionine Sulphoximine，MSX)抑制内源性GS活性，用(yòng)含目的基因和(hé)GS基因标記的表達載體,轉染宿主CHO細胞,通過MSX加壓篩選，促使GS基因和(hé)目的蛋白(bái)基因擴增,隻有轉染了(le)額外(wài)GS基因的細胞才可以在不含有谷氨酰胺（L-glutamine）的培養基中生長,從(cóng)而篩選獲得重組表達細胞株。

篩選策略

01宿主細胞選擇

工(gōng)業上(shàng)主要使用(yòng)兩大(dà)類CHO細胞：

①GS野生型,含弱的GS活性(GS WT):CHO-K1(ATCC CCL-61,ECACC 85051005)，CHOK1SV(lonza);

②GS缺陷型,敲除GS活性(GS KO):CHOK1SV-KO(Lonza),CHOZN(Merk),HD-BIOP3(Horizon)。

02細胞株篩選

細胞轉染是将外(wài)源分子(如DNA,RNA)導入真核細胞，細胞株篩選方案包括一系列步驟：

重組載體構建

選擇适合的信号肽，對(duì)抗體重輕鏈基因進行密碼子優化。将目的基因構建到(dào)普健專有的GS載體上(shàng)。

02轉染及Minipools篩選

使用(yòng)普健生物專利（2019111820312、201910992950X、202111448761x、202211173542X）的CHO細胞轉染方法進行轉染。轉染48h後,加壓篩選Minipools。利用(yòng)ELISA或Octet進行初篩，選取最優的30個minipools,逐級擴大(dà)培養至TPP搖管中,利用(yòng)簡單的流加表達工(gōng)藝篩選出3個最優的minipools。

03細胞株單克隆化

采用(yòng)特定的有限稀釋方法鋪闆,Imager跟蹤成像。利用(yòng)ELISA或Octet進行初篩，選取最優的30個單克隆,逐級擴大(dà)培養至TPP搖管中，利用(yòng)簡單的流加表達工(gōng)藝篩選出10株最優的單克隆。将10株最優的單克隆傳至搖瓶中,利用(yòng)特定的搖瓶工(gōng)藝對(duì)10株單克隆進行細胞生長特性,代謝(xiè)特性,産量,抗體糖基化修飾,抗體聚體等質量分析，綜合篩選出最優的3株生産用(yòng)細胞株。

04個性化産量優化和(hé)糖型調節

普健生物有多種基礎培養基，補料培養基及流加表達培養方案。可以根據不同的細胞株生長特性,篩選出最優的流加表達工(gōng)藝。同時(shí),也(yě)可以用(yòng)特定的調糖培養基調節不同的糖型的比例。

05完善的抗體質量評估系統

主要包括:抗體效價、活性分析,抗體聚體分析,抗體糖基化分析,抗體效能(néng)分析等。

06生産細胞株穩定性分析

包括基因型穩定性分析及30個代次的傳代穩定性分析。

案例展示

構建生産重組抗體的CHO穩定細胞株。

Fig.1 單克隆産量分析

Fig.2 流加表達測試産量優化

Fig.3 抗體聚體分析（SEC-HPLC）

Fig.4 抗體親和(hé)力分析（Biacore）

Fig.5 細胞株穩定性分析圖

XtenCHO^TM高(gāo)密度表達系統的轉染試劑、表達培養基和(hé)補料培養基相較于常用(yòng)的陽離子脂質體轉染試劑、商業化CHO培養基以及補料培養基,成本大(dà)大(dà)降低(dī),更适用(yòng)于工(gōng)業生産,在規模較大(dà)的重組蛋白(bái)瞬時(shí)表達生産中更能(néng)體現(xiàn)其性價比高(gāo)的特點。

普健生物穩定細胞株構建服務

普健生物擁有高(gāo)效的CHO穩定細胞株構建體系，從(cóng)上(shàng)遊的雜(zá)交瘤抗體測序，到(dào)序列優化，人源化，再到(dào)細胞株構建，個性化細胞株優化及質控檢測，整個技術體系成熟，儀器配備齊全，能(néng)夠快(kuài)速助力抗體藥的臨床前研究。普健生物憑借十餘年的抗體藥物研發項目經驗，自(zì)主開(kāi)發了(le)CHO-GS KO細胞系及GS載體系統，抗體表達産量>3g/L以上(shàng)。自(zì)主研發了(le)CHO細胞專利轉染技術，及提高(gāo)抗體産量的穩定細胞株篩選技術。擁有完善的抗體質量分析平台，可以提供ELISA、FACS、還原/非還原SDS-PAGE、SDS-CE、SEC-HPLC、LC-MS、ADCC和(hé)Biacore等分析。

服務流程

服務優勢

高(gāo)質：外(wài)源基因嚴格鑒定，細胞來(lái)源清晰，無污染。

高(gāo)産：重組蛋白(bái)/抗體表達量可快(kuài)速優化至2g/L以上(shàng)穩定表達。

穩定：獨有的GS穩轉系列載體配合MSX藥物篩選，實現(xiàn)穩定傳代15-30代以上(shàng)。

快(kuài)速：篩選高(gāo)産細胞株，周期短至3個月。

靈活定制：可針對(duì)重組蛋白(bái)/抗體全長或片段進行個性化表達。

經驗豐富：專業的技術團隊，已成功爲國内外(wài)多家醫(yī)藥公司和(hé)研究單位構建交付穩定細胞株。

多篩選系統：G418/潮黴素/嘌呤黴素篩選系統，GS/DHFR 篩選系統等。