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生物藥開(kāi)發是一個非常複雜(zá)的過程，而構建适用(yòng)于工(gōng)業生産的高(gāo)表達的細胞株是第一步也(yě)是最關鍵的步驟之一。CHO細胞的GS篩選系統是工(gōng)業上(shàng)用(yòng)得最廣泛的篩選系統。CHO細胞GS篩選系統主要有以下(xià)優點：
① CHO細胞遺傳背景清楚，很(hěn)少分泌内源蛋白(bái)，利于外(wài)源蛋白(bái)的分離純化。
② GS篩選系統産量高(gāo)，周期快(kuài)，工(gōng)業認證度高(gāo)。
基于豐富的重組表達抗體生産經驗及穩轉細胞株構建經驗，小(xiǎo)普在這(zhè)裏給大(dà)家分享一種高(gāo)效的抗體藥開(kāi)發CHO細胞株構建策略。
01
GS篩選系統原理(lǐ)
哺乳細胞的生長離不開(kāi)谷氨酰胺，谷氨酰胺合成酶是一種能(néng)将谷氨酸和(hé)氨合成爲谷氨酰胺的酶。這(zhè)種酶促反應是動物細胞獲得谷氨酰胺的途徑。
CHO細胞内源的谷氨酰胺合成酶活性比較低(dī)，無法表達足夠的谷氨酰胺維持細胞快(kuài)速生長，必須在培養基中添加外(wài)源的谷氨酰胺。GS抑制劑，L-氨基亞砜蛋氨酸（Methionine Sulphoximine，MSX），可用(yòng)于抑制内源性GS活性，用(yòng)含目的基因和(hé)GS基因标記的表達載體，轉染宿主CHO細胞，通過MSX加壓篩選，促使GS基因和(hé)目的蛋白(bái)基因擴增，隻有轉染了(le)額外(wài)GS基因的細胞才可以在不含有L-glutamine的培養基中生長，從(cóng)而篩選獲得重組表達細胞株。
02
篩選策略
2.1 宿主細胞選擇
工(gōng)業上(shàng)主要使用(yòng)兩大(dà)類CHO 細胞：① GS野生型，含弱的GS活性（GS WT）：CHO-K1（ATCC CCL-61，ECACC 85051005），CHOK1SV（lonza)；② GS缺陷型，敲除GS活性（GS KO）：CHOK1SV-KO（Lonza),CHOZN（Merk）,HD-BIOP3(Horizon)。
使用(yòng)這(zhè)些(xiē)商業化的細胞株，需要支付高(gāo)額的專利費用(yòng)。普健生物憑借近十年的抗體藥物研發項目經驗，自(zì)主開(kāi)發了(le)CHO-GS KO細胞系及GS載體系統，經過大(dà)量的重組表達項目驗證，産量高(gāo)達3g/L以上(shàng)，穩定性好(hǎo)。
2.2 細胞株篩選方案
① 重組載體構建。選擇适合的信号肽，對(duì)抗體重輕鏈基因進行密碼子優化。将目的基因構建到(dào)普健專有的GS載體上(shàng)。
② 轉染及Minipools篩選。使用(yòng)普健生物專利（2019111820312、201910992950X、202111448761x、202211173542X）的CHO細胞轉染方法進行轉染。轉染48h後，加壓篩選Minipools。利用(yòng)Elisa 或Octet進行初篩，選取最優的30個minipools，逐級擴大(dà)培養至TPP搖管中，利用(yòng)簡單的流加表達工(gōng)藝篩選出3株最優的minipools。
③ 細胞株單克隆化。采用(yòng)特定的有限稀釋方法鋪闆，Imager跟蹤成像。利用(yòng)Elisa或Octet進行初篩，選取最優的30個monoclones，逐級擴大(dà)培養至TPP搖管中，利用(yòng)簡單的流加表達工(gōng)藝篩選出10株最優的monoclones。将10株最優的monoclones傳至搖瓶中，利用(yòng)特定的搖瓶工(gōng)藝對(duì)10株monoclones 進行細胞生長特性，代謝(xiè)特性，産量，抗體糖基化修飾，抗體聚體等質量分析，綜合篩選出最優的3株生産用(yòng)細胞株。
④ 個性化産量優化和(hé)糖型調節。普健生物有多種基礎培養基，補料培養基及流加表達培養方案。可以根據不同的細胞株生長特性， 篩選出最優的流加表達工(gōng)藝。同時(shí)，也(yě)可以用(yòng)特定的調糖培養基調節不同的糖型的比例。
⑤ 完善的抗體質量評估系統。主要包括抗體效價，活性分析；抗體聚體分析；抗體糖基化分析；抗體效能(néng)分析等。
⑥ 生産細胞株穩定性分析。包括基因型穩定性分析及30個代次的傳代穩定性分析。
03
案例展示
圖1 單克隆産量分析
圖2 流加表達測試産量優化
圖3 抗體聚體分析（SEC-HPLC）
圖4 抗體親和(hé)力分析（Biocore）
圖5 細胞株穩定性分析圖
04
穩定細胞株構建服務
高(gāo)效的CHO穩定細胞株構建體系，需要從(cóng)上(shàng)遊的雜(zá)交瘤抗體測序，到(dào)序列優化，人源化，再到(dào)細胞株構建，個性化細胞株優化及質控檢測，整個技術體系成熟，儀器配備齊全，能(néng)夠快(kuài)速助力抗體藥的臨床前研究。CHO-GS KO細胞系及GS載體系統，抗體表達産量>3g/L以上(shàng)。CHO細胞專利轉染技術，及提高(gāo)抗體産量的穩定細胞株篩選技術。完善的抗體質量分析平台，可以提供Elisa、FACS、還原/非還原SDS-PAGE、SDS-CE、SEC-HPLC、LC-MS、ADCC和(hé)Biacore等分析。
優勢
高(gāo)質：外(wài)源基因嚴格鑒定，細胞來(lái)源清晰，無污染。
高(gāo)産：重組蛋白(bái)/抗體表達量可快(kuài)速優化至2g/L以上(shàng)穩定表達。
穩定：獨有的GS穩轉系列載體配合MSX藥物篩選，實現(xiàn)穩定傳代15-30代以上(shàng)。
快(kuài)速：篩選高(gāo)産細胞株，周期短至3個月。
靈活定制：可針對(duì)重組蛋白(bái)/抗體全長或片段進行個性化表達。
經驗豐富：專業的技術團隊，已成功爲國内外(wài)多家醫(yī)藥公司和(hé)研究單位構建交付穩定細胞株。
多篩選系統：G418/潮黴素/嘌呤黴素篩選系統，GS/DHFR 篩選系統等。
