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Selli等人發現(xiàn)，雖然攜帶CD28的嵌合抗原受體（CAR）T細胞通過腫瘤或慢性感染刺激下(xià)發生的經典事(shì)件，從(cóng)而發生功能(néng)障礙和(hé)耗竭，但(dàn)攜帶4-1BB的CAR-T細胞則以由轉錄因子FOXO3驅動的不同方式發生功能(néng)障礙。
十多年前，CAR-T細胞被證明(míng)對(duì)B細胞惡性腫瘤具有顯着的療效。它們均靶向B細胞分子CD19，并帶有CD28或4-1BB中1個共刺激分子的胞内信号域。研究者假設将共刺激結構域并入CAR可改善持久性和(hé)功能(néng)，從(cóng)而改善抗腫瘤作(zuò)用(yòng)。由于這(zhè)些(xiē)初始産品取得顯著的初步成功，美(měi)國食品和(hé)藥物管理(lǐ)局批準的所有6種構建物，包括針對(duì)骨髓瘤漿細胞表達的b細胞成熟抗原的構建物，以及臨床開(kāi)發中的大(dà)多數其他(tā)CAR，包括各種适應症，都包含這(zhè)兩個信号域中的一個。
由于CAR以高(gāo)親和(hé)力識别抗原，并且由組成型啓動子表達，因此研究者早期注意到(dào)，抗原的持續刺激（有時(shí)甚至是CAR的高(gāo)水(shuǐ)平表達）可導緻T細胞功能(néng)障礙。這(zhè)些(xiē)功能(néng)失調的T細胞在抗原刺激後的細胞毒性、細胞因子産生和(hé)增殖能(néng)力降低(dī)；這(zhè)可以通過中斷信号轉導中的休息來(lái)克服。在患者中，高(gāo)腫瘤負荷與應答(dá)降低(dī)和(hé)T細胞功能(néng)障礙增加相關。到(dào)目前爲止，這(zhè)種功能(néng)障礙被認爲在本質上(shàng)與T細胞“耗竭”是相同的現(xiàn)象，而T細胞“耗竭”已經在接受檢查點阻斷治療的慢性病毒感染和(hé)癌症中得到(dào)了(le)廣泛描述。
Selli等通過重複體外(wài)刺激攜帶CD28或4-1BB胞内信号域的CD19導向的CAR T細胞來(lái)模拟慢性激活，從(cóng)而産生功能(néng)障礙，然後對(duì)轉錄、表觀遺傳和(hé)表型程序進行了(le)全面分析。每48小(xiǎo)時(shí)用(yòng)低(dī)效靶比的新腫瘤細胞刺激CAR T細胞。2周後，CAR T細胞失去了(le)殺傷抗原陽性靶點的能(néng)力，不能(néng)再産生細胞因子，也(yě)不能(néng)再增殖。接下(xià)來(lái)，他(tā)們利用(yòng)飛(fēi)行時(shí)間的多參數細胞測定法從(cóng)表型上(shàng)研究了(le)這(zhè)些(xiē)功能(néng)失調的CAR T細胞。研究發現(xiàn)，含有CD28的CAR - T細胞具有典型T細胞耗竭的特征，包括PD-1、TIGIT、LAG3、TIM3和(hé)CTLA4的重新表達（見圖）。相比之下(xià)，攜帶4-1BB CARs的功能(néng)失調T細胞占據不同的T分布随機鄰居嵌入空(kōng)間，其表面表達更高(gāo)的CD62L和(hé)CD25。使用(yòng)RNA測序檢查這(zhè)些(xiē)功能(néng)失調的CAR T細胞的轉錄程序顯示，基于CD28的CAR T細胞高(gāo)度富集與耗竭相關的基因，而基于4- 1BB的功能(néng)失調的CAR T細胞沒有典型的耗竭标簽。
最近關于T細胞衰竭的研究強調，這(zhè)種狀态是由特定的表觀遺傳改變決定的。研究人員還使用(yòng)染色質開(kāi)放(fàng)性測序技術（ATAC-seq）證實了(le)這(zhè)些(xiē)差異，特别是PD1編碼基因（PDCD1）的染色質可及性測定法，在基于CD28的CAR T細胞中，這(zhè)看(kàn)起來(lái)像是典型的耗竭，但(dàn)在基于4- 1BB的CAR T細胞中并非如此。研究人員随後使用(yòng)縱向單細胞RNA測序，确定大(dà)多數功能(néng)失調的4-1BB CAR T細胞是由一組涉及細胞毒性（GNLY、CCL5、PRF1、GZMA、GZMK、CTSW）、自(zì)然殺傷細胞特性（KLRK1、KLRC2）和(hé)T細胞分化（ID2）的獨特基因定義，他(tā)們将這(zhè)些(xiē)基因稱爲TBBD标簽。有趣的是，他(tā)們的TBBD标簽在接受抗CD19 /4- 1BB CAR構建物Tisagenlecleucel治療的1例患者中得到(dào)了(le)證實，該患者雖然血液中有CAR T細胞，但(dàn)淋巴瘤仍發生進展。
攜帶不同共刺激結構域的CAR-T細胞在慢性刺激後功能(néng)失調時(shí)表現(xiàn)出不同的轉錄、表觀遺傳和(hé)表型特征。攜帶4-1BB共刺激結構域的CAR-T細胞重新激活FOXO3，其驅動一種不同于經典T細胞衰竭的新功能(néng)障礙程序。
爲了(le)了(le)解這(zhè)種功能(néng)障礙的新型分子程序的起源，研究團隊研究了(le)随着時(shí)間的推移轉錄因子結合的可及性。正如預期的那樣，CD28-CAR功能(néng)障礙增加了(le)Jun:Fos（AP1）結合的可及性，但(dàn)相反，4-1BB-CAR功能(néng)障礙打開(kāi)了(le)同源盒（HOX）和(hé)叉頭框（FOX）位點，并且小(xiǎo)的條理(lǐ)性RNA測序數據顯示FOXO3活性高(gāo)。此外(wài)，在機制研究中，通過CRISPR/Cas幹擾FOXO3可使患者對(duì)重複抗原刺激後的功能(néng)障礙産生抵抗，相反，FOXO3過表達顯著減少了(le)4-1BB（而非CD28） CAR T細胞在重複抗原刺激下(xià)的擴增。在小(xiǎo)鼠異種移植應激模型中，注射極少量的CAR T細胞治療較高(gāo)的腫瘤負荷，攜帶4-1BB胞内信号域的FOXO3敲除CAR T細胞改善了(le)生存。
值得注意的是，研究人員通過深度技術探究（從(cóng)高(gāo)維細胞測定到(dào)縱向單細胞RNA測序）發現(xiàn)了(le)一種新的分子機制，同時(shí)仍然使用(yòng)相對(duì)簡單的體外(wài)模型（重複抗原刺激）。分子程序本身和(hé)FOXO3的重新激活是有趣的，可能(néng)在自(zì)然界中并不常見。在自(zì)然生物學中，4-1BB刺激與T細胞受體（TCR）刺激在時(shí)間上(shàng)分離，而TCR表達本身随着抗原暴露而循環，因此減少了(le)緊張信号傳導的可能(néng)性。未來(lái)的研究可能(néng)包括在更多接受Tisagenlecleucel治療但(dàn)無應答(dá)的患者中進一步驗證TBBD轉錄特征和(hé)FOXO3活性。同樣，無論疾病狀态如何，我們都應基于對(duì)新生CD19+ B細胞的長期暴露，進一步了(le)解Tisagenlecleucel在患者中是否會(huì)耗竭。有趣的是，在接受治療的前2例患者（這(zhè)2例患者均有長期緩解）中，長期暴露于新生B細胞被認爲在Tisagenlecleucel持續10年的過程中發揮了(le)作(zuò)用(yòng)。此外(wài)，當BCMA陽性骨髓瘤患者在使用(yòng)BCMA導向的CAR T細胞持續存在的情況下(xià)複發時(shí)，對(duì)于對(duì)其他(tā)抗原具有特異性的、攜帶4- 1BB的CAR T細胞（例如已批準用(yòng)于多發性骨髓瘤的兩種靶向B細胞成熟抗原[BCMA]的CAR T細胞）是否也(yě)表現(xiàn)出TBBD标簽和(hé)FOXO3再激活，這(zhè)将是該領域的興趣。最後，在機制水(shuǐ)平，研究FOXO3敲除或C-Jun過表達在減少CAR-T細胞耗竭方面是否更有效将是有趣的。
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