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用(yòng)于分子診斷和(hé)疾病的單克隆抗體
廣泛應用(yòng)于抗原檢測和(hé)人類疾病的抗體因其高(gāo)度特異性和(hé)低(dī)毒性使成爲了(le)極具前景的醫(yī)藥商品。實際上(shàng)，它們是僅次于疫苗的第二大(dà)臨床開(kāi)發生物藥品類别。自(zì)1997年FDA批準首個抗體藥——抗cd20嵌合抗體利妥昔單抗以來(lái)，利妥昔單抗已成爲許多非霍奇金(jīn)淋巴瘤治療策略的組成部分。
單克隆抗體通常通過用(yòng)抗原免疫實驗動物(如小(xiǎo)鼠)獲得，篩選得到(dào)一株産生特異性抗體的雜(zá)交瘤。雜(zá)交瘤技術是最常用(yòng)的單克隆抗體制備技術之一，但(dàn)由于實驗動物免疫系統存在偏差，這(zhè)限制了(le)獲得針對(duì)保守哺乳動物蛋白(bái)的高(gāo)親和(hé)力抗體的能(néng)力。尤其是在應用(yòng)于針對(duì)人類的治療性抗體的領域，這(zhè)些(xiē)蛋白(bái)質的異源性通常使它們對(duì)人類具有免疫原性，從(cóng)而引發HAMA反應(人類抗小(xiǎo)鼠抗體)。
抗體人源化繞開(kāi)了(le)這(zhè)一瓶頸，通過用(yòng)人框架同源序列替換小(xiǎo)鼠序列來(lái)最大(dà)限度地減少HAMA應答(dá)。人源化抗體已成爲當今許多疾病治療的現(xiàn)實，包括癌症的治療和(hé)診斷。然而，一些(xiē)應用(yòng)可能(néng)會(huì)受到(dào)其分子大(dà)小(xiǎo)的限制。它們對(duì)組織(如實體瘤)的穿透性較差，并且通過空(kōng)間約束與某些(xiē)分子表面的功能(néng)重要區(qū)域結合較差或不結合。抗體片段，如Fab(片段抗原結合)，scFv(單鏈可變片段)是減少抗體大(dà)小(xiǎo)和(hé)增加其滲透到(dào)組織的替代方案，納米抗體的出現(xiàn)完美(měi)解決了(le)這(zhè)一難題。
構建和(hé)篩選絲狀噬菌體表面人源抗體組合文(wén)庫是獲得人源抗體及其片段的适宜方法。這(zhè)些(xiē)文(wén)庫可以是合成的，也(yě)可以從(cóng)人類患者的庫中獲得，結合物的選擇是針對(duì)之前定義的配體，從(cóng)而産生完全人源性抗體片段，理(lǐ)論上(shàng)的免疫原性低(dī)于鼠源或人源化抗體片段。抗體噬菌體展示技術爲研究、診斷和(hé)治療提供了(le)大(dà)量的人源重組抗體。2003年，FDA批準了(le)第一種噬菌體展示抗體阿達木(mù)單抗(Adalimumab)用(yòng)于類風(fēng)濕性關節炎。目前，它還廣泛用(yòng)于銀屑病、關節炎、強直性脊柱炎和(hé)克羅恩病。接下(xià)來(lái)我們将主要梳理(lǐ)來(lái)自(zì)幼稚細胞或免疫文(wén)庫的Fab、scFv、sdAb或其他(tā)抗體片段的例子。
抗體噬菌體展示庫
噬菌體展示技術由George P.Smith于1985年提出，描述外(wài)源肽在噬菌體顆粒表面的呈現(xiàn)。這(zhè)是基于觀察到(dào)，來(lái)自(zì)Inoviridae家族的噬菌體(M3,fd,fl)經過适當包裝，即使在外(wài)源肽與其衣殼蛋白(bái)融合的情況下(xià)仍保持感染性。通過基因操作(zuò)獲得噬菌體展示文(wén)庫。數以億計(jì)的肽、蛋白(bái)變體、抗體片段編碼基因被克隆到(dào)一個融合到(dào)絲狀噬菌體外(wài)殼蛋白(bái)(pIII或pVIII)基因5'的載體中。這(zhè)些(xiē)噬菌體庫被用(yòng)來(lái)轉化細菌，這(zhè)些(xiē)細菌也(yě)會(huì)被輔助噬菌體感染。輔助噬菌體感染使病毒顆粒在其表面顯示融合蛋白(bái)。由于外(wài)殼蛋白(bái)僅爲展示肽提供錨定，因此不應幹擾其結構，并允許肽及其相應基因的親和(hé)純化。這(zhè)一原理(lǐ)也(yě)适用(yòng)于抗體片段在絲狀噬菌體表面的呈遞。
可以采用(yòng)不同的策略獲得抗體組合噬菌體展示文(wén)庫。根據人類可變輕庫(VL)和(hé)可變重庫(VH)構建了(le)一些(xiē)合成或半合成文(wén)庫。最常用(yòng)的是Griffin-1文(wén)庫，它由體内使用(yòng)的大(dà)部分人類VH和(hé)VL基因片段組成，使用(yòng)合成的寡核苷酸産生更多的CDR3多樣性(半合成)，以及Tomlinson I文(wén)庫，它由單一的人類框架組成，多樣性包含在VH和(hé)VL結構域的18個氨基酸位置，主要位于抗原結合位點(合成)。在這(zhè)兩個庫中，抗體均顯示爲scFvs。從(cóng)這(zhè)些(xiē)文(wén)庫中獲得了(le)幾種人抗體，單獨或聯合用(yòng)于生物淘洗工(gōng)藝。另一種策略是通過擴增一個或多個個體的可變基因庫來(lái)構建文(wén)庫。爲此，我們使用(yòng)了(le)覆蓋所有V基因家族的引物，文(wén)庫由VL和(hé)VH鏈編碼基因随機組合而成。同樣，抗體編碼基因被組裝成Fab或scFv抗體片段。從(cóng)理(lǐ)論上(shàng)講，每個克隆都編碼一個特定的抗原結合位點，該位點來(lái)自(zì)于通過人工(gōng)結構域外(wài)推原始結構域而增加的自(zì)然結構域。
淘選過程在體外(wài)模拟了(le)B細胞克隆篩選系統，方法是特異性富集具有所需特異性抗體的噬菌體顆粒。在建庫過程中，确保庫的多樣化是很(hěn)重要的，因此庫的大(dà)小(xiǎo)對(duì)于嘗試爲任何特定抗原選擇結合形式的有效性是至關重要的。組合抗體庫可以從(cóng)免疫或未免疫的供體中構建。可選擇提供針對(duì)不同類型抗原的高(gāo)親和(hé)力抗體:半抗原、蛋白(bái)質、多肽和(hé)碳水(shuǐ)化合物
篩選方法大(dà)多基于4個主要步驟:制備噬菌體展示文(wén)庫，吸附特異性結合噬菌體，去除非特異性或低(dī)親和(hé)力噬菌體，回收目标結合物，細菌感染後再擴增，進行下(xià)一輪篩選。篩選過程導緻噬菌體與所選的純或不純抗原特異性結合的順序富集。這(zhè)些(xiē)篩選步驟将重複3-5次，直到(dào)鑒定出高(gāo)特異性/親和(hé)力的結合物。
普健生物噬菌體展示抗體發現(xiàn)平台具有強大(dà)的篩選能(néng)力，滿足高(gāo)通量抗體開(kāi)發需求，擁有包括随機肽庫、免疫庫和(hé)天然庫在内的千億級庫容，可以構建多物種（人源、小(xiǎo)鼠、兔子、羊駝等）抗體文(wén)庫以及多種類型（scfv、Fab、VHH 等）的抗體文(wén)庫。
選擇細胞表面的噬菌體是發展腫瘤靶向治療的重要一步。它爲獲得針對(duì)未知(zhī)和(hé)非免疫原性細胞表面抗原的抗體提供了(le)機會(huì)。随着靶抗原越來(lái)越複雜(zá)，如細胞表面，選擇過程變得更加困難。細胞膜上(shàng)有大(dà)量的蛋白(bái)質、碳水(shuǐ)化合物和(hé)脂類作(zuò)爲潛在抗原。它們的表達水(shuǐ)平可因細胞而異，這(zhè)使得相關抗原在所有細胞膜成分中存在的量很(hěn)小(xiǎo)。因此，每一輪的選擇都需要相對(duì)大(dà)量的細胞，這(zhè)使得該技術對(duì)于通常從(cóng)器官和(hé)組織中獲得的小(xiǎo)細胞群的應用(yòng)變得困難。但(dàn)噬菌體展示文(wén)庫在這(zhè)裏就體現(xiàn)出了(le)強大(dà)的應用(yòng)前景。
普健生物噬菌體文(wén)庫的類型
随機肽庫：将化學合成的随機寡核苷酸序列與噬菌體的表面蛋白(bái)基因融合，在噬菌體表面表達出各種氨基酸組合的 随機序列短肽。利用(yòng)噬菌體展示随機肽庫可以高(gāo)通量篩選各種抗原的抗原表位
免疫庫：免疫庫由經過免疫 ( 包括疫苗注射、微生物感染、自(zì)身免疫疾病、腫瘤等 ) 後的供體 B 淋巴細胞的抗體 基因構建。對(duì)于特定免疫抗原的抗體淘選的效率較高(gāo)，但(dàn)一般僅适用(yòng)于一種特異性抗體的選擇，庫容量要求不高(gāo)，一般
106-108的庫容量就可滿足需要
天然庫：采用(yòng)不經免疫的人或動物來(lái)源的外(wài)周血淋巴細胞、骨髓、脾細胞的 B 細胞作(zuò)爲材料，進行基因擴增，但(dàn)親 和(hé)力通常較低(dī)。骨髓内和(hé)骨髓外(wài)所有抗體基因都包含在内，所構建的抗體庫适用(yòng)于所有抗原所對(duì)應的抗體的選擇，庫容 量要求較高(gāo)，最小(xiǎo)需要達到(dào) 109 ，因爲目前估算(suàn)的自(zì)然界的抗原種類在這(zhè)個數量級上(shàng)
普健生物噬菌體展示技術平台優勢
1. 豐富的噬菌體抗體技術經驗，五年以上(shàng)噬菌體抗體開(kāi)發，交付上(shàng)百個噬菌體展示抗體開(kāi)發項目
2. 具有全人源重組抗體庫，庫容高(gāo)達千億級别（1011 pfu)，兩步建庫法，保證了(le)文(wén)庫的多樣性，抗體庫片段插入
正确率高(gāo)；可以兩周拿到(dào)全人源重組抗體
3. 可以構建多物種（人源、小(xiǎo)鼠、兔子、羊駝等）抗體文(wén)庫
4. 可以構建多種類型（scfv、Fab、VHH 等）的抗體文(wén)庫
噬菌體展示技術爲快(kuài)速發現(xiàn)腫瘤抗原抗體提供了(le)有力的手段。它容易實現(xiàn)，操作(zuò)方便，成功率高(gāo)。與小(xiǎo)鼠雜(zá)交瘤技術産生的抗體相比，噬菌體展示技術抗體的優點是直接分離出全人源抗體，而小(xiǎo)鼠雜(zá)交瘤技術需要費力地将候選引物人源化。目前，許多噬菌體展示抗體已進入生物制藥市場。單克隆抗體通過調節固有的腫瘤細胞通路和(hé)激活針對(duì)腫瘤細胞的固有免疫反應，已成爲标準的抗癌藥物。顯然，噬菌體展示技術衍生的人類抗體可以與早期産品競争，隻要它們針對(duì)的是明(míng)确定義的靶點，如EGFR或VEGF通路。噬菌體展示技術在藥物研發中發揮着重要作(zuò)用(yòng)，許多噬菌體分子已獲得FDA批準，許多噬菌體分子已進入臨床試驗。我們可以期待，在不久的将來(lái)會(huì)有更大(dà)的改進，噬菌體展示将爲腫瘤學帶來(lái)更多的貢獻。
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