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自(zì)1942年首次發現(xiàn)以來(lái)，免疫熒光染色一直是一種高(gāo)度可靠和(hé)強大(dà)的技術，用(yòng)于廣泛的研究和(hé)診斷目的。
用(yòng)熒光分子标記的白(bái)血病細胞
通常，熒光抗體（FA）技術将涉及使用(yòng)細胞或抗體，其恒定區(qū)域已用(yòng)熒光标記标記（也(yě)稱爲熒光團）标記。FA技術通常分爲直接或間接。
直接熒光抗體
直接熒光抗體技術，也(yě)可以稱爲直接免疫熒光（DIF），涉及使用(yòng)單個熒光标記的一抗，用(yòng)于與靶抗原結合。當臨床使用(yòng)時(shí)，DIF對(duì)于快(kuài)速診斷細菌性疾病特别有用(yòng)，如化膿性鏈球菌（通常稱爲鏈球菌）以及肺炎支原體和(hé)嗜肺軍團菌屬引起的肺炎。
出于這(zhè)種診斷目的，首先将患者樣本放(fàng)在顯微鏡載玻片上(shàng)，然後暴露于熒光抗體中。熒光标記抗體和(hé)靶抗原（在這(zhè)些(xiē)情況下(xià)是細菌）之間的任何結合都會(huì)導緻這(zhè)些(xiē)物質在用(yòng)熒光顯微鏡檢查時(shí)發光。
除了(le)用(yòng)作(zuò)診斷工(gōng)具外(wài)，DIF還廣泛用(yòng)于科學研究。爲此，将切成5或6微米（μm）薄片的冷凍組織樣品放(fàng)置在載玻片上(shàng)。
然後将載玻片與熒光标記抗體一起孵育，熒光标記抗體通常包括一組針對(duì)IgA，IgG和(hé)IgM抗體同種型的抗體以及針對(duì)目标抗原的補體3。
請(qǐng)注意，用(yòng)于此類研究的抗體濃度将基于先前的實驗，這(zhè)些(xiē)實驗已确認哪種濃度可以達到(dào)最高(gāo)的信噪比。
在載玻片在黑暗和(hé)室溫下(xià)孵育至少30分鐘(zhōng)後，洗滌載玻片，然後用(yòng)熒光顯微鏡成像。
間接熒光抗體
與用(yòng)于DIF的單步技術相比，間接IF（IIF）或間接FA（IFA）是一個兩步過程，首先将未标記的一抗施加到(dào)針對(duì)靶抗原的樣品上(shàng)。IIF的第二步涉及使用(yòng)熒光标記的二抗，該二抗針對(duì)一抗的Fc部分。
盡管IIF被認爲比DIF更複雜(zá)，因爲它需要更長的時(shí)間才能(néng)完成并且需要使用(yòng)兩種兼容的抗體，但(dàn)它在靈敏度方面更勝一籌。
IFA測試的一些(xiē)常見臨床應用(yòng)包括用(yòng)于診斷梅毒的測試。對(duì)于這(zhè)種類型的IFA測試，先前從(cóng)研究動物中分離出的T. Palladium細胞被分離并放(fàng)置在載玻片的表面上(shàng)。然後将從(cóng)患者獲得的血清散布在钯錐蟲細胞上(shàng)，以允許抗密螺旋體抗體（如果存在）與固定抗原結合。
沖洗掉患者的血清樣本後，加入用(yòng)熒光團标記的二抗。梅毒陽性結果将照亮(liàng)所有二抗-熒光團偶聯物複合物。
另一種廣泛用(yòng)于臨床環境的IFA是用(yòng)于診斷系統性紅(hóng)斑狼瘡（SLE）的IFA。SLE是一種自(zì)身免疫性疾病，其循環抗核自(zì)身抗體（ANA）水(shuǐ)平将增加，這(zhè)些(xiē)抗體針對(duì)DNA和(hé)與DNA結合的各種蛋白(bái)質。
對(duì)于這(zhè)種類型的IFA測試，将細胞培養，然後放(fàng)置在載玻片上(shàng)。然後将每張載玻片與不同濃度的患者抗體一起孵育，然後洗滌以去除任何未結合的蛋白(bái)質。在洗滌步驟之後，将熒光标記的二抗（用(yòng)于ANA測試）添加到(dào)載玻片中并使其孵育。然後從(cóng)顯示熒光的最高(gāo)血清稀釋度中獲得血清中 ANA 的滴度，并用(yòng)于确定 SLE 診斷。
流式細胞術
第三種類型的熒光抗體技術包括流式細胞術，這(zhè)是一種自(zì)動細胞計(jì)數系統，可用(yòng)于定量存在于複雜(zá)混合物（如血液或血清）中的特定細胞。
典型的流式細胞術實驗将從(cóng)孵育熒光标記的抗體開(kāi)始，該抗體針對(duì)特定的細胞亞群，例如抗CD4，其可以與各種免疫細胞表面發現(xiàn)的糖蛋白(bái)CD4結合，包括T輔助細胞，單核細胞和(hé)巨噬細胞。流式細胞術還可以通過使用(yòng)适當的細胞制造商來(lái)量化多種細胞類型的存在。
孵育完成後，将樣品引入流式細胞儀。在這(zhè)台機器中，狹窄的毛細管迫使樣品中存在的細胞在單個文(wén)件中移動。當細胞穿過毛細管時(shí)，激光用(yòng)于激活和(hé)激發任何已用(yòng)熒光團标記的細胞。
然後通過正向和(hé)側向散射檢測器測量每個激發細胞的熒光強度，并将其描繪在直方圖上(shàng)進行分析。除了(le)定量目的外(wài)，流式細胞術和(hé)免疫熒光都可用(yòng)于通過稱爲熒光激活細胞分選儀（FACS）的技術将細胞分選爲純化的亞群以進行研究。
參考文(wén)獻
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[2]Parker, N., Schneegurt, M., Tu, A. T., et al. (2016). Chapter 20.5 Fluorescent Antibody Techniques. In: Microbiology.
[3]Betterle, C., & Zanchetta, R. (2012). The immunofluorescence techniques in the diagnosis of endocrine autoimmune diseases. Autoimmunity Highlights 3(2); 67-78. DOI:10.1007/s13317-012-0034-3.
