聯系我們
嗜肺軍團菌（legionella pneumophila，LP）是一類單極鞭毛革蘭陰性杆菌，能(néng)引發軍團病。LP可入侵人肺泡巨噬細胞，阻礙巨噬細胞自(zì)噬，躲避巨噬細胞對(duì)其徹底清除，并在巨噬細胞内增殖，達到(dào)感染宿主的最終目标。LP 的脂多糖、菌毛、鞭毛等都與軍團菌的緻病性相關，鞭毛蛋白(bái)是其重要的毒力因子，可加強病原菌的侵襲。
鞭毛蛋白(bái)是 Toll 樣受體 5（TLR5）的特異性配體，TLR5 作(zuò)爲模式識别受體，在緻病菌侵襲宿主時(shí)，TLR5 依靠胞外(wài)的 LRR 蛋白(bái)結構域（LRR domain）識别鞭毛蛋白(bái)，并觸發依賴髓樣分化因子 88（MyD88）的信号通路，激活微管相關蛋白(bái)激酶（microtubule -associated protein kinase，MAPK）和(hé)核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB）誘導的炎性反應，有效清除病原體。
來(lái)自(zì)甯夏醫(yī)科大(dà)學基礎醫(yī)學院、銀川市第三人民醫(yī)院的研究人員在此前的研究中，使用(yòng)LP 鞭毛重組蛋白(bái)A（rflaA）幹預RAW264.7巨噬細胞，發現(xiàn)組蛋白(bái)去乙酰化酶6（histone deacetylase 6，HDAC6）增高(gāo)。HDAC6是一種位于細胞質的去乙酰化酶，參與多種生物過程的調控，包括自(zì)噬、熱休克反應和(hé)腫瘤進展等。HDAC6還參與了(le)線粒體吞噬和(hé)錯誤折疊蛋白(bái)向溶酶體和(hé)蛋白(bái)酶體的運輸。爲了(le)探究HDAC6在rflaA抑制巨噬細胞自(zì)噬中的作(zuò)用(yòng)，研究人員選擇 HDAC6-/-C57BL/6J 小(xiǎo)鼠巨噬細胞作(zuò)爲此次實驗的研究對(duì)象。
采用(yòng)支氣管肺泡灌洗法提取C57BL/6J與HDAC6-/-C57BL/6J兩種小(xiǎo)鼠巨噬細胞，用(yòng)小(xiǎo)鼠巨噬細胞表面标記物F4/80鑒定；純化rflaA，CCK-8 法檢測其對(duì)小(xiǎo)鼠巨噬細胞半數抑制濃度（IC50），篩選最佳作(zuò)用(yòng)濃度用(yòng)于後續實驗；rflaA分别幹預C57BL/6J 及HDAC6-/-C57BL/6J小(xiǎo)鼠巨噬細胞6、12和(hé)24 h，RT-qPCR、Western blot 及免疫熒光檢測各組自(zì)噬相關因子自(zì)噬效應蛋白(bái)1（Be－clin1）、自(zì)噬相關蛋白(bái) 5（ATG5）、自(zì)噬微管相關蛋白(bái)輕鏈 3（LC3）、SQSTM1 蛋白(bái)（P62）的表達水(shuǐ)平。
根據CCK-8結果計(jì)算(suàn)，IC50爲0.41 μg·μL-1，最佳作(zuò)用(yòng)濃度爲0.041 μg·μL-1用(yòng)于後續實驗；RT-qPCR、Westernblot、免疫熒光結果顯示，rflaA幹預C57BL/6J小(xiǎo)鼠巨噬細胞後，與0 h相比，6、12、24 h HDAC6的表達水(shuǐ)平升高(gāo)，LC3、ATG5表達水(shuǐ)平均降低(dī)，P62的表達水(shuǐ)平升高(gāo)，Beclin1的表達水(shuǐ)平先降低(dī)後升高(gāo)（P 均＜0.05）；rflaA幹預HDAC6-/-C57BL/6J小(xiǎo)鼠巨噬細胞後，與0 h 相比，6、12、24 h LC3、ATG5、Beclin1表達水(shuǐ)平均升高(gāo)，P62的表達水(shuǐ)平降低(dī)（P均＜0.05）；在相同的時(shí)間點，與C57BL/6J小(xiǎo)鼠巨噬細胞各組相比，HDAC6敲除後各組細胞ATG5、LC3 表達水(shuǐ)平升高(gāo)，Beclin1先升高(gāo)後降低(dī)，P62降低(dī)（P均＜0.05）。
RT-qPCR 檢測敲除 HDAC6 對(duì) rflaA 幹預小(xiǎo)鼠巨噬細胞不同時(shí)間點自(zì)噬相關因子 mRNA 表達的影響
Western blot 檢測敲除 HDAC6 對(duì) rflaA 幹預小(xiǎo)鼠巨噬細胞不同時(shí)間點自(zì)噬相關因子蛋白(bái)表達的影響
LP rflaA幹預C57BL/6J小(xiǎo)鼠單核巨噬細胞後，能(néng)抑制其自(zì)噬，提示rflaA可能(néng)被TLR5識别，激活炎症小(xiǎo)體使巨噬細胞内脂質化的LC3脫脂，特異性地阻斷LC3-PE和(hé)ATG5相互作(zuò)用(yòng)，脫脂後的LC3未與溶酶體融合，從(cóng)而阻斷自(zì)噬體-溶酶體途徑，LC3、ATG5的表達降低(dī)，吞噬體-溶酶體融合受損導緻P62積累，積累的P62會(huì)與HDAC6結合通過泛素結合區(qū)來(lái)維持其去乙酰基酶活性，導緻α-tubulin的去乙酰化，P62通過維持HDAC6活性使微管不穩定從(cóng)而抑制自(zì)噬。
随着時(shí)間發展，巨噬細胞的功能(néng)逐漸恢複，rflaA的抑制作(zuò)用(yòng)減弱，HDAC6 的活性開(kāi)始恢複，表達水(shuǐ)平升高(gāo)，誘導表達的Be－clin1表達水(shuǐ)平升高(gāo)，Beclin1-PIK3C3複合體形成增多，自(zì)噬活性開(kāi)始逐漸恢複。
HDAC6作(zuò)爲一種去乙酰化酶，當HDAC6敲除後，rflaA對(duì)巨噬細胞自(zì)噬的抑制作(zuò)用(yòng)降低(dī)，巨
噬細胞乙酰化作(zuò)用(yòng)增強，微管蛋白(bái)穩定性增加，微管的運輸功能(néng)恢複，有助于恢複自(zì)噬通量，乙酰化酶P300乙酰化修飾LC3，導緻LC3表達增加。細胞自(zì)噬途徑激活LC3表達上(shàng)調後，自(zì)噬誘導Beclin1的乙酰化作(zuò)用(yòng)增強，Beclin1乙酰化能(néng)夠促進自(zì)噬體的成熟和(hé)降解，自(zì)噬小(xiǎo)體和(hé)自(zì)噬溶酶體融合順暢，自(zì)噬作(zuò)用(yòng)增強，Beclin1表達升高(gāo)。而LC3靶向自(zì)噬體膜是由ATG5 決定的，ATG5的表達也(yě)相應升高(gāo)。
HDAC6和(hé)P62作(zuò)爲泛素結合蛋白(bái)，參與自(zì)噬調控。HDAC6 催化從(cóng)各種細胞質蛋白(bái)中去除乙酰基，并包含一個泛素結合域，通過此結合域将錯誤折疊和(hé)損壞的蛋白(bái)靶向到(dào)自(zì)噬小(xiǎo)體中。當細胞蛋白(bái)質被破壞時(shí)，聚集體的形成就會(huì)發生。聚集體的形成是一種對(duì)錯誤折疊損傷蛋白(bái)的細胞保護反應，并通過自(zì)噬誘導其清除。這(zhè)些(xiē)蛋白(bái)酶體與P62共定位，并通過選擇性巨自(zì)噬被清除，所以當敲除HDAC6後，爲了(le)促進泛素聚集體和(hé)自(zì)噬降解，P62爲了(le)招募吞噬體膜上(shàng)的LC3膜蛋白(bái)用(yòng)于自(zì)噬體成熟，而自(zì)身被自(zì)噬降解，故自(zì)噬底物P62減少，P62的表達下(xià)調。
這(zhè)充分表明(míng)，HDAC6 促進rflaA抑制小(xiǎo)鼠巨噬細胞自(zì)噬，HDAC6可能(néng)通過影響微管蛋白(bái)乙酰化幹擾巨噬細胞自(zì)噬。這(zhè)項研究爲HDAC6在rflaA幹擾巨噬細胞自(zì)噬中的影響提供新的思路，爲進一步了(le)解HDAC6在LP鞭毛蛋白(bái)緻病機制中的作(zuò)用(yòng)奠定基礎。
參考文(wén)獻
ZHENG Ronghui,LI Pan,CAO Xiuqin,CHEN Minjia,CHEN Haixia,YANG Zhiwei.HDAC6 Regulates Flagellar Recombinant Protein A Interference Macrophage Autophagy[J].Ningxia Medical University,2023(06):573-580592.doi:10.16050/j.cnki.issn1674-6309.2023.06.006
