聯系我們
骨形态發生蛋白(bái)4（Bone morphogenetic protein 4,BMP4）是骨形成蛋白(bái)家族的一員，隸屬于 TGF-β超家族，在調節胚胎發育、幹細胞分化和(hé)成人組織穩态等方面起重要的調控作(zuò)用(yòng)。
在過往的研究中，Klösch等将鼠源BMP4在重組大(dà)腸杆菌中進行了(le)表達，但(dàn)表達系統不能(néng)對(duì)外(wài)源蛋白(bái)進行修飾，會(huì)形成不溶解、無活性的包涵體，并存在後期蛋白(bái)複性實驗煩瑣、複性率較低(dī)等問題；Cha等将人源BMP4在中國倉鼠卵巢細胞中進行了(le)表達，結果證明(míng)哺乳動物活細胞表達系統在大(dà)量生産蛋白(bái)時(shí)成本較高(gāo)，不适合大(dà)規模生産的需求。在BMP4蛋白(bái)純化方面，普遍選擇使用(yòng)親和(hé)層析技術，如免疫親和(hé)層析、染料－配體親和(hé)層析、固定化金(jīn)屬離子親和(hé)層析等，但(dàn)親和(hé)層析技術雖然操作(zuò)方便，卻同樣存在成本較高(gāo)、不宜大(dà)規模生産等問題。因此，優化BMP4表達方法、提高(gāo)利用(yòng)效率、降低(dī)純化成本，對(duì)後續研發和(hé)生産至關重要。
畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統是近年來(lái)發展迅速、應用(yòng)廣泛的一種真核表達系統。它是甲醇營養型酵母菌，有兩個乙醇氧化酶（Alcohol oxidase，AOX）編碼基因AOX1和(hé)AOX2，兩者序列相似，AOX1基因嚴格受甲醇誘導和(hé)調控。當甲醇爲唯一碳源時(shí)，AOX1啓動子可被甲醇誘導，啓動乙醇氧化酶的表達，從(cóng)而用(yòng)甲醇進行代謝(xiè)，含AOX1 啓動子的質粒可用(yòng)來(lái)促進編碼外(wài)源蛋白(bái)的目的基因的表達。在此研究中，來(lái)自(zì)吉林(lín)師範大(dà)學生命科學學院、吉林(lín)大(dà)學基礎醫(yī)學院的研究人員以骨形态發生蛋白(bái)（BMP4）爲研究對(duì)象，将BMP4基因與IgG Fc 基因結合，改造成爲BMP4融合蛋白(bái)，經畢赤酵母誘導表達和(hé)DEAE陰離子純化獲得目的蛋白(bái)，并利用(yòng)間充質幹細胞驗證了(le)其生理(lǐ)活性。
畢赤酵母表達系統是目前較爲常見的表達系統之一，其優點在于表達高(gāo)效、穩定性好(hǎo)、生産成本低(dī)，可根據需要選擇胞内或胞外(wài)分泌路徑。其中，胞外(wài)分泌表達純化工(gōng)藝簡單、生産成本低(dī)，适用(yòng)于工(gōng)業生産。用(yòng)不同質量分數的甲醇對(duì)同一菌種進行誘導并對(duì)重組蛋白(bái)純化進行優化。
離子交換層析方法可以根據電荷性質差異分離電離分子，具有處理(lǐ)能(néng)力強、适用(yòng)廣泛、成本
适中等優點，同時(shí)還有易于放(fàng)大(dà)和(hé)自(zì)動化處理(lǐ)等特性，在大(dà)批量生産中發揮重要的作(zuò)用(yòng)。采用(yòng)離子交換層析法分離、純化目的蛋白(bái)，通過BMP4形成二聚體時(shí)具有促進間充質幹細胞增殖的特性，驗證了(le)BMP4-Fc融合蛋白(bái)的活性。
畢赤酵母表達系統可對(duì)目的蛋白(bái)進行翻譯後修飾，具有高(gāo)效分泌表達的真核表達系統。畢赤酵母表達系統主要優勢：
1. 含有特有的強有力的 AOX（醇氧化酶基因）啓動子，用(yòng)甲醇可嚴格地調控外(wài)源基因的表達
2. 産物易分離，畢赤酵母所用(yòng)發酵培養基十分廉價，一般碳源爲甘油或葡萄糖及甲醇，其餘爲無機鹽，培養基中
不含蛋白(bái)，有利于下(xià)遊産品分離純化
3. 外(wài)源蛋白(bái)基因遺傳穩定，外(wài)源基因能(néng)以高(gāo)拷貝數整合到(dào)畢赤酵母基因組中，不易丢失并能(néng)夠得到(dào)高(gāo)表達菌株
4. 作(zuò)爲真核表達系統，畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結構，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白(bái)磷酸化等翻譯後修飾加工(gōng)功能(néng)
該項研究進一步純化了(le)重組蛋白(bái)、優化了(le)DEAE離子交換層析條件，發現(xiàn)在230mmol/L NaCl和(hé)20mmol/L Tris-HCl混合液洗脫條件下(xià)，可以除去大(dà)部分雜(zá)蛋白(bái)，得到(dào)純度較高(gāo)、生理(lǐ)活性好(hǎo)、接近商業化純品水(shuǐ)平的目的蛋白(bái)，爲BMP4的進一步研究、開(kāi)發和(hé)利用(yòng)提供了(le)參考依據。
參考文(wén)獻：
[1].ZHAO Zhuo,JI Hao-tian,XIAO Ye-chen.Vector construction and purification analysis on recombinant BMP4 protein in Pichia pastoris.[J].JournalofNortheastNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Vol.54No.1.March 2022
