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腫瘤細胞代謝(xiè)的研究是近年腫瘤領域的研究熱點之一。研究發現(xiàn)大(dà)部分的腫瘤促進因子或抑制因子直接影響腫瘤細胞代謝(xiè)分子。其中糖酵解分子的表達、活性及調控對(duì)腫瘤的發生、發展、轉移、消退起着至關重要的作(zuò)用(yòng)。在腫瘤細胞增殖過程中，糖酵解所涉及的分子，包括轉運分子、關鍵酶及限速酶，都成爲新的抗腫瘤藥物靶點。相應的，以腫瘤細胞代謝(xiè)爲靶向的新藥研發也(yě)成爲當今新型抗腫瘤藥物研發的主要方向之一。
6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2, 6-雙磷酸酶(PFKFB) 分子是目前受明(míng)顯關注的影響腫瘤代謝(xiè)的一組分子。PFKFB是控制果糖-2, 6-二磷酸(F-2, 6-BP)水(shuǐ)平的家族性雙功能(néng)酶。這(zhè)類酶的N端能(néng)在F-6-P與ATP存在的條件下(xià)合成F-2, 6-BP。相反的, PFKFB也(yě)能(néng)在果糖-2, 6-二磷酸酶C端作(zuò)用(yòng)下(xià)催化上(shàng)述反應的逆反應，即F-2, 6-BP水(shuǐ)解爲F-6-P和(hé)無機正磷酸鹽。在葡萄糖的代謝(xiè)過程中，6-磷酸果糖-1-激酶(PFK-1) 催化F-6-P轉變成果糖-1, 6-二磷酸(F-1, 6-BP)是關鍵的限速步驟。而PFKFB的産物F-2, 6-BP是PFK-1最強的激活劑。因此，抑制PFKFB的表達或活性進而降低(dī)F-2, 6-BP水(shuǐ)平，可顯著抑制PFK1的活性，進而抑制細胞糖代謝(xiè)，最終抑制細胞的增殖。相應地，調節PFKFB及F-2, 6-BP的水(shuǐ)平可以抑制腫瘤的發生發展。
哺乳動物的PFKFB有4種異構體，其中PFKFB3是目前與腫瘤最相關的PFKFB靶标。PFKFB3編碼的6-磷酸果糖-2-激酶(PFK2)激酶活性較其磷酸酶活性高(gāo)700餘倍，而由PFKFB1、2、4編碼的PFK2其激酶活性比其磷酸酶活性稍高(gāo)或兩者活性相當。無論是實驗性的離體及在體腫瘤生長，都需要PFKFB3存在。很(hěn)多來(lái)自(zì)人的腫瘤标本中，與其相鄰近的正常細胞相比，腫瘤細胞中PFKFB3的表達明(míng)顯增高(gāo) ，這(zhè)些(xiē)腫瘤包括膠質瘤、乳腺癌、結腸癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌及卵巢癌等。
來(lái)自(zì)佛山科學技術學院、廣州中醫(yī)藥大(dà)學基礎醫(yī)學院、北京大(dà)學深圳研究生院的研究人員利用(yòng)大(dà)腸杆菌表達系統，通過在感受态細胞BL21(DE3)中轉入PFKFB3原核質粒，經終濃度爲25μg/ml的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導，在16℃培養細菌過夜，表達PFKFB3重組蛋白(bái)。冰上(shàng)超聲破菌，離心收集蛋白(bái)，通過鎳 (Ni) 柱親和(hé)層析和(hé)分子篩純化蛋白(bái)，運用(yòng)焦磷酸-磷酸果糖激酶 (PPi-PFK) 法測定PFKFB3酶活性。
蛋白(bái)豐度圖譜結果顯示，PFKFB3蛋白(bái)經過Ni柱親和(hé)層析和(hé)分子篩純化後，基本隻有1個 PFKFB3的強吸收峰，純化效果良好(hǎo)。
應用(yòng)考馬斯亮(liàng)藍法測定PFKFB3蛋白(bái)濃度爲2~4μg/μl, 成功獲得了(le)較高(gāo)純度和(hé)濃度的PFKFB3重組蛋白(bái)。
通過 PPi -PFK 酶活性分析法測得 PFKFB3 的果糖 -6- 磷酸 (F-6-P) 和(hé)三磷酸腺苷 (ATP) 位點的米氏常數 (Km) 值分别爲 142.5、34.21 μmol/L。
這(zhè)項研究構建了(le)PFKFB3的原核表達載體，通過大(dà)腸杆菌表達後，提取純化PFKFB3蛋白(bái)并對(duì)其酶性質進行了(le)測定，爲PFKFB3結構和(hé)功能(néng)的進一步研究及抑制劑的篩選提供材料并奠定基礎。
參考文(wén)獻：
[1].MAI Wei-qian, ZHENG Min-cheng.Expression, purification and enzyme activity determination of recombination protein PFKFB3.[J].Chin J Mod Drug Appl, Dec 2022, Vol. 16, No. 23
