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糖基化修飾在藥物蛋白(bái)功能(néng)、穩定性及血漿半衰期等方面起到(dào)重要作(zuò)用(yòng)。真核生物中糖基化修飾蛋白(bái)在維持蛋白(bái)穩定、細胞信号轉導、免疫調控、細胞間的互作(zuò)、細菌-宿主識别互作(zuò)等過程中發揮着重要功能(néng)。
N-糖基化修飾是蛋白(bái)糖修飾的主要方式之一，寡糖通過與新生肽鏈中特定天冬酰胺的酰胺氮連接。在原核生物中也(yě)廣泛存在寡糖合成途徑與 N-糖基化修飾蛋白(bái)質機制，形成病原菌外(wài)膜上(shàng)的脂寡糖。脂寡糖在病原菌黏附和(hé)宿主細胞侵入、逃避宿主免疫防禦中發揮重要作(zuò)用(yòng)。
大(dà)腸埃希菌是人體不可缺少單細胞生物。大(dà)腸埃希菌，俗名大(dà)腸杆菌（革蘭氏陰性短杆菌），周身鞭毛，能(néng)運動，無芽。是人和(hé)動物腸道(dào)中的正常栖居菌。
2002 年，瑞士聯邦理(lǐ)工(gōng)學院Wacker 等研究人員首次将空(kōng)腸彎曲杆菌( Campylobacter jejuni) N-糖基化基因簇( pgl) 轉入大(dà)腸杆菌，成功地在大(dà)腸杆菌工(gōng)程菌株中N-糖基化修飾外(wài)源蛋白(bái)質，開(kāi)創了(le)利用(yòng)大(dà)腸杆菌 N-糖基化修飾重組蛋白(bái)新紀元。近 20 年間，人們利用(yòng)不同來(lái)源的糖基化轉移酶、寡糖轉移酶，在大(dà)腸杆菌中開(kāi)展類人源和(hé)人源化 N-糖基化重組蛋白(bái)、病原菌寡糖的糖疫苗制備研究。
利用(yòng)大(dà)腸杆菌表達系統制備N-糖基化重組蛋白(bái)的機制
天然原核生物 N-糖基化修飾系統主要由4個必要元件組成:糖基化識别序列、糖基轉移酶
(glycosyl transferase，GT) 、糖苷酶、糖底物供體，它們分别負責接受、添加、修剪和(hé)提供底物以合成寡糖，并進一步通過依賴寡糖轉移酶( oligosaccharyl transferase，OST) /非依賴 OST的途徑将寡糖轉移到(dào)靶蛋白(bái)上(shàng)。将以上(shàng)機制轉移到(dào)大(dà)腸杆菌中，實現(xiàn) N-糖基化重組蛋白(bái)，可重塑合成寡糖鏈及重組蛋白(bái)修飾，将在糖疫苗生産、糖基化修飾藥物蛋白(bái)等方面具有巨大(dà)應用(yòng)潛力。
Schematic diagram of the main mechanism of N-glycosylated recombinant protein production via Escherichia coli
A: OST-dependent N-glycosylation system; B: OST-independent N-glycosylation system
應用(yòng)大(dà)腸杆菌表達系統制備N-糖基化重組蛋白(bái)
利用(yòng)大(dà)腸杆菌表達系統生産糖基化基因工(gōng)程抗體等重組蛋白(bái)及糖疫苗是目前熱點研究方向。自(zì)2012 年Aebi課題組首次利用(yòng)大(dà)腸杆菌實現(xiàn)類人源化糖鏈Man3GlcNAc2核心五糖 N-糖基化修飾重組蛋白(bái)後，利用(yòng)多種原核生物進行糖基化修飾的技術一直在不斷探索中，其技術核心是将其他(tā)原核生物來(lái)源的寡糖轉移酶（識别并将寡糖轉移到(dào)重組蛋白(bái)上(shàng)的糖基化識别序列上(shàng)）和(hé)多種糖基轉移酶（非模闆驅動合成寡糖）在大(dà)腸杆菌中共表達，完成寡糖合成及 N-糖基化定點修飾蛋白(bái)基本過程。
近幾年研究結果表明(míng)該系統可以實現(xiàn)定點（識别特異氨基酸序列）、均質性（糖鏈微觀均質、糖蛋白(bái)宏觀均質）修飾重組蛋白(bái)，這(zhè)是真核系統無法比拟的優勢。真核細胞合成的聚糖性質較其他(tā)合成途徑而言與人的更爲相似（如圖）。但(dàn)是，天然真核細胞表達系統糖表位修飾N-糖基化重組蛋白(bái)的均質性很(hěn)低(dī)，這(zhè)種異質性源于哺乳動物複合型N-多糖合成的多步驟過程。
Schematic diagram of antibody glycosylation modification in eukaryotic cells
普健生物擁有十餘年的蛋白(bái)表達經驗，經過不斷的探索和(hé)改進，開(kāi)發了(le)建立了(le)3H（High through、High efficiency、High quality）大(dà)腸杆菌表達系統，擁有獨特的表達純化及複性平台，95%以上(shàng)的超高(gāo)蛋白(bái)表達成功率，已成功交付上(shàng)萬例大(dà)腸杆菌表達服務項目。如果您有大(dà)腸杆菌重組蛋白(bái)表達與純化項目需求，歡迎聯系027-87001869與我們的專員進行溝通！
Schematic diagram of the production of N-glycosylated recombinant proteins using Escherichia coli
A: Ｒecombinant protein pathway modified by N-glycosylation in Escherichia coli; B: Cell-free glycoprotein synthesis pathway
O-糖基化修飾可以增加治療性蛋白(bái)的穩定性和(hé)體内循環時(shí)間。雖然糖基化修飾對(duì)每種蛋白(bái)質的影響可能(néng)不同，但(dàn)研究顯示N-糖基化修飾可通過以下(xià)方式改善蛋白(bái)的理(lǐ)化性質:
①通過屏蔽非結構化、疏水(shuǐ)性或易于蛋白(bái)酶作(zuò)用(yòng)的蛋白(bái)質區(qū)域來(lái)防止變性、聚集和(hé)降解；
②增加分子的分子量和(hé)流體動力學半徑以減少腎濾過；
③去除免疫原性，減少免疫系統清除；
④覆蓋或去除可被人凝集素識别/清除的末端結構。
目前，利用(yòng)大(dà)腸埃希菌解決了(le)均質性修飾N-糖基化修飾重組蛋白(bái)問題。該技術有望首先在糖疫苗生産方面得到(dào)産業化應用(yòng)。
參考文(wén)獻
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