高(gāo)效實現(xiàn)長效化重組蛋白(bái)制備 助力長效重組蛋白(bái)藥物開(kāi)發

相比傳統小(xiǎo)分子藥物，重組蛋白(bái)藥物具有高(gāo)活性、高(gāo)特異性和(hé)低(dī)毒性等多種獨特優勢，但(dàn)囿于機體内蛋白(bái)水(shuǐ)解、腎髒消除、肝髒代謝(xiè)以及免疫清除等影響，往往導緻重組蛋白(bái)藥物的體内半衰期短，使用(yòng)受限。

當藥物進入系統時(shí)，由各種酶引起的代謝(xiè)，尤其是多種形式的蛋白(bái)水(shuǐ)解酶的作(zuò)用(yòng)，可導緻藥物降解爲小(xiǎo)分子肽或者氨基酸。這(zhè)類酶廣泛存在于胃、腸道(dào)，其分布具有細胞組織的特異性。非蛋白(bái)酶因素的影響來(lái)源于蛋白(bái)質物理(lǐ)或化學上(shàng)的變化。物理(lǐ)變化包括聚合、沉澱；化學變化包括氨基酸殘基的修飾，主要有氧化作(zuò)用(yòng)、還原作(zuò)用(yòng)、脫酰胺反應、水(shuǐ)解反應、β消除、二硫化物交換等幾種反應，并且蛋白(bái)質在構建中的穩定性和(hé)免疫原性以及導緻蛋白(bái)質化學結構錯誤變化的環境條件也(yě)被認爲是影響蛋白(bái)質代謝(xiè)穩定性的主要因素。較大(dà)的多肽常通過受體介導的方式來(lái)清除，有不少例子顯示，受體介導的清除可能(néng)是一種主要的清除機制。

基于以上(shàng)的清除機制，延長蛋白(bái)半衰期的策略主要分爲保護酶解識别位點的結構改造策略、改善蛋白(bái)理(lǐ)化性質的天然或人工(gōng)多聚物修飾策略以及降低(dī)免疫原性的碳水(shuǐ)化合物修飾策略等。

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重組蛋白(bái)藥物的發展趨勢有以下(xià)兩個特點：

第一，哺乳動物細胞作(zuò)爲表達體系的比例增加。原因在于，原核表達系統(如大(dà)腸杆菌E. coli)，适合分子量較小(xiǎo)、不需要翻譯後修飾的非糖基化蛋白(bái)(如胰島素、生長激素、幹擾素和(hé)白(bái)細胞介素等)；而哺乳動物細胞表達系統可進行複雜(zá)的翻譯後修飾(如蛋白(bái)質折疊、糖基化和(hé)二硫鍵的形成)，表達的蛋白(bái)質與天然蛋白(bái)質更爲接近，且能(néng)通過控制翻譯後修飾實現(xiàn)預期功效。

第二，長效化重組蛋白(bái)的進展較大(dà)。利用(yòng)化學修飾、基因工(gōng)程技術等對(duì)蛋白(bái)質藥物進行改造或修飾，解決大(dà)分子蛋白(bái)質藥物血液中半衰期短、給藥途徑單一、免疫原性和(hé)毒副反應等問題，增強藥物活性、提高(gāo)藥效等，是近年來(lái)生物技術藥物發展的趨勢。長效蛋白(bái)質生物制劑技術的研究一直是大(dà)分子蛋白(bái)質藥物的研究熱點，國際上(shàng)許多大(dà)公司紛紛開(kāi)展蛋白(bái)質藥物長效制劑的開(kāi)發研究，搶占核心技術的制高(gāo)點。

重組蛋白(bái)藥物長效化技術常用(yòng)化學修飾、突變體構建、蛋白(bái)融合、糖基化等策略。化學修飾如聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)修飾、聚磷酸酯（PPE）修飾、聚羧基甜菜堿（Poly( carboxybetaine)，PCB）修飾、多聚唾液酸(Polysialition，PSA)、脂肪酸修飾等。它們通過化學的方法将蛋白(bái)質藥物與大(dà)分子親水(shuǐ)修飾劑進行共價偶聯的方法。共價連接到(dào)大(dà)分子上(shàng)能(néng)減小(xiǎo)免疫原性，改善可溶性和(hé)生物學利用(yòng)度，以及增加抗蛋白(bái)水(shuǐ)解作(zuò)用(yòng)，同時(shí)也(yě)能(néng)夠延長半衰期。

構建突變體是将蛋白(bái)分子一個位點或多個位點進行突變，以期改善蛋白(bái)穩定性，提高(gāo)親和(hé)力或活性，降低(dī)免疫原性等，是蛋白(bái)藥物設計(jì)的一個重點方向。

蛋白(bái)融合也(yě)被認爲是天然蛋白(bái)修飾，包括Fc融合蛋白(bái)和(hé)人血清白(bái)蛋白(bái)融合蛋白(bái)。Fc融合蛋白(bái)是指利用(yòng)基因工(gōng)程等技術将某種具有生物學活性的功能(néng)蛋白(bái)分子與Fc片段融合而産生的新型蛋白(bái)質，功能(néng)蛋白(bái)可以是能(néng)結合内源性受體(或配體)的可溶性配體(或受體)分子或其他(tā)需要延長半衰期的活性物質(如細胞因子)。Fc融合蛋白(bái)大(dà)大(dà)增加活性蛋白(bái)或多肽的分子量，降低(dī)腎小(xiǎo)球的濾過率，而FcRn (Neonatal Fc receptor，新生兒Fc受體)介導的再循環機制可以避免蛋白(bái)降解，有效延長半衰期。

Fc融合蛋白(bái)的發展分爲兩個階段：第一階段，對(duì)于小(xiǎo)分子肽通過表達二聚體融合蛋白(bái)實現(xiàn)延長藥物的半衰期(例如禮來(lái)糖尿病藥物Trulicity)；第二階段，對(duì)于分子量大(dà)于30 kDa的大(dà)分子蛋白(bái)使用(yòng)二聚體Fc和(hé)單體蛋白(bái)策略。作(zuò)爲目前最爲成功的蛋白(bái)長效化手段之一，目前已有10多種批準上(shàng)市的Fc融合蛋白(bái)藥物。

人血清白(bái)蛋白(bái)( Human serum albumin，HSA) 是血漿中含量最高(gāo)的蛋白(bái)質，相對(duì)分子質量66500，半衰期約19 d。作(zuò)爲一種長效的天然蛋白(bái)，其長效機制在于HSA在弱酸性的溶酶體( pH6.0) 環境中可通過結構域III結合FcRn，随後通過FcRn的跨膜作(zuò)用(yòng)被重新轉運至血液，并在中性血液中( pH7.4) 被釋放(fàng)，避免了(le)溶酶體的降解作(zuò)用(yòng)。作(zuò)爲天然蛋白(bái)，HAS 還具有親水(shuǐ)穩定、安全無毒等優點，藥物可以通過基因融合或共價修飾的方式直接結合，也(yě)可以通過結合 HSA配體與其非共價結合，因此 HSA 可作(zuò)爲理(lǐ)想的天然修飾物。

蛋白(bái)質的糖基化(Glycosylation)是真核生物的一種常見翻譯後修飾方式，是某些(xiē)蛋白(bái)質發揮生物活性所必需的。蛋白(bái)質表面的糖鏈能(néng)夠影響蛋白(bái)質的藥物動力學作(zuò)用(yòng)、生物活性、穩定性、對(duì)蛋白(bái)酶的易感性、水(shuǐ)溶性、凝集性、免疫原性等。因此糖基化修飾也(yě)是延長半衰期的常用(yòng)手段。

具體說來(lái)，糖基化可分爲N-糖基化與O-糖基化。N-糖基化是指聚糖通過糖苷酰胺連接在 Asn-X-Ser/Thr共有序列中Asn殘基的側鏈上(shàng)，工(gōng)程上(shàng)N-糖基化通常通過引入Asn-X-Ser/Thr序列，增加N-糖基化位點完成。O-糖基化則是聚糖通過O-糖苷鍵連接到(dào)Ser側鏈或Thr的羟基上(shàng)。

需要說明(míng)的是，作(zuò)爲典型的翻譯後修飾手段，糖基化修飾往往需要通過工(gōng)程化哺乳動物細胞完成，修飾糖的種類、數量、分子大(dà)小(xiǎo)、序列和(hé)電荷等因素對(duì)于藥物理(lǐ)化性質和(hé)生物活性的影響複雜(zá)而特異，并有助于提高(gāo)藥物的靶向性。然而由于糖基化可控性低(dī)，因此糖基化藥物在應用(yòng)上(shàng)仍面臨着産率低(dī)、控制困難等技術挑戰。

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