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豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）是尼多病毒目（Nidovirales,又叫巢穴病毒目或套式病毒目）、冠狀病毒科（Coronaviridae）的α冠狀病毒屬成員，能(néng)夠引起新生仔豬急性腹瀉、嘔吐、脫水(shuǐ)甚至死亡。
PEDV表面具有1個18~23nm纖突的囊膜結構，纖突呈花(huā)瓣狀，由核心向四周呈放(fàng)射狀分布，纖突末端呈球狀；病毒直徑爲95~190nm，是一種單股正鏈、不分節段RNA病毒。PEDV基因組大(dà)小(xiǎo)約爲28kb，含有７個開(kāi)放(fàng)閱讀框，分别編碼大(dà)小(xiǎo)爲150~220kDa的病毒纖突糖蛋白(bái)（S）、20~30kDa的基質蛋白(bái)（M）、7kDa的主要嵌膜蛋白(bái)（E）、58kDa的核衣殼蛋白(bái)（N）與其他(tā)蛋白(bái)。病毒表面的纖突蛋白(bái)（spike，S）具有介導細胞附着和(hé)膜融合的作(zuò)用(yòng)。
目前預防豬流行性腹瀉（PED）的疫苗常用(yòng)甲醛氫氧化鋁滅活苗，但(dàn)疫苗株與近期流行株同源性較低(dī)，能(néng)保護仔豬免受PEDV流行株感染的高(gāo)效廉價的疫苗需求更加迫切。爲此，來(lái)自(zì)中國農(nóng)業科學院的研究團隊針對(duì)高(gāo)發的GⅡ-a型流行株豬PEDV的纖突蛋白(bái)中的受體結合區(qū)（re-ceptor-bindingdomain,RDB），應用(yòng)昆蟲杆狀病毒表達系統構建并表達了(le)PEDV-RDB基因，通過仔豬試驗，分析其免疫原性，爲PED亞單位疫苗研制提供新思路。
PEDV-RDB基因在昆蟲杆狀病毒中的表達與鑒定
根據PEDV S蛋白(bái)基因序列(AKN45969.1)将目的基因設計(jì)合成之後，将合成的基因PEDV-RBD亞克隆至杆狀病毒雙表達載體的PH啓動子下(xià)遊，進行重組和(hé)鑒定。對(duì)重組杆粒Bacmid-PER進行鑒定，利用(yòng)引物進行PCR擴增，鑒定成功後随後對(duì)其進行轉染，獲得重組杆狀病毒rBV-PER。
PEDV-RBD基因結構示意圖
左：重組質粒鑒定 右：PCR鑒定
最後利用(yòng)Anti-strep tag抗體和(hé)抗PEDV S蛋白(bái)抗體對(duì)重組杆狀病毒進行IFA鑒定，表明(míng)外(wài)源PEDV-RBD基因在杆狀病毒中成功表達。
IFA鑒定PEDV-RBD蛋白(bái)的表達
重組蛋白(bái)pFBD-PER的Western blot鑒定
普健生物昆蟲杆狀病毒表達系統物利用(yòng)經典Bac-to-Bac 技術，打造了(le)一個快(kuài)速簡便高(gāo)效的杆狀病毒表達平台；能(néng)夠快(kuài)速地産生重組病毒，而且不需要繁瑣的空(kōng)斑分析，大(dà)大(dà)提高(gāo)了(le)效率，蛋白(bái)生産的周期短，通量大(dà)。可以實現(xiàn)細胞從(cóng)小(xiǎo)規模培養到(dào)大(dà)規模發酵的過程，使得蛋白(bái)産物甚至可以達到(dào)100mg/L 的級别。如果您有相關重組蛋白(bái)表達和(hé)制備需求，歡迎聯系027-87001869與我們的專員進行溝通！
利用(yòng)杆狀病毒表達系統制備豬流行性腹瀉病毒（PEDV）纖突蛋白(bái)受體結合區(qū)（RDB）重組蛋 白(bái)（PEDV-RDB），将其免疫３周齡斷乳仔豬，分析其免疫原性。将PEDV-RBDP3代重組杆狀病毒接種到(dào)懸浮SF9細胞中，收獲後離心取上(shàng)清液，将上(shàng)清液超速離心濃縮重組蛋白(bái)。将仔 豬分爲免疫組、空(kōng)載體對(duì)照組和(hé)佐劑對(duì)照組，分别用(yòng)制備的重組蛋白(bái)、空(kōng)載體表達産物和(hé)單純佐劑免疫仔豬。
特異性抗體檢測結果
左：仔豬血清中和(hé)抗體檢測結果 右：流式細胞術分析
結果顯示，免疫後８周，PEDV-RDB重組蛋白(bái)組産生的特異性抗體效價達1:12800，中和(hé)抗體平均效價1:284，最高(gāo)達1:512。流式細胞術分析CD3+CD4+雙陽性Ｔ淋巴細胞顯著高(gāo)于對(duì)照組，表明(míng)重組蛋白(bái)具有良好(hǎo)的免疫原性，能(néng)夠激發仔豬的體液免疫和(hé)細胞免疫應答(dá)。
這(zhè)項研究這(zhè)爲進一步利用(yòng)杆狀病毒載體制備亞單位疫苗奠定了(le)基礎，也(yě)爲利用(yòng)昆蟲杆狀病毒表達系統進行其他(tā)冠狀病毒蛋白(bái)的免疫研究提供了(le)借鑒和(hé)參考。
參考文(wén)獻
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