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結核病( tuberculosis，TB) 是由結核分枝杆菌( Mycobacterium tuberculosis，MTB )引起的傳染 病。結核分枝杆菌（MTB）俗稱結核杆菌（tubercle bacillus），菌細長略彎曲，有時(shí)可見分枝，呈單、成堆或成束排列，無鞭毛、無芽胞，有莢膜。可出現(xiàn)多形性，在陳舊的病竈和(hé)培養物中，形态常不典型，可呈顆粒狀，串球狀，短棒狀，長絲形等。MTB革蘭染色陽性，不産生内外(wài)毒素。
Genome of M. tuberculosis
結核分枝杆菌基因組大(dà)小(xiǎo)爲4.4 Mb，基因組G/C含量高(gāo)達65.6%，預測含4411個開(kāi)放(fàng)閱讀框(ORF)，其中3924個ORF被認爲編碼蛋白(bái)質，50個基因編碼穩定的RNA。如由MTB Rv3875基因編碼的早期分泌抗原靶6 kDa蛋白(bái)(early secretory antigenic target of 6 kDa, ESAT-6)能(néng)誘導強烈的T細胞免疫應答(dá)，并提供一定的抗結核免疫保護；Rv3804c基因編碼的Ag85A蛋白(bái)是MTB的主要分泌蛋白(bái)Ag85複合物成分之一，可使細胞毒性T細胞的細胞毒活力升高(gāo)；Rv2660c基因編碼的蛋白(bái)在MTB處于休眠狀态時(shí)仍能(néng)持續表達，提示Rv2660c基因可作(zuò)爲清除潛伏性感染階段MTB的作(zuò)用(yòng)靶點；Rv3428c位于MTB的RD11 區(qū)，編碼插入序列IS1532 的轉座酶，可引起體内的細胞與體液免疫，Rv3428c編碼的重組蛋白(bái)具有增加γ－幹擾素在小(xiǎo)鼠中的表達潛力，可作(zuò)開(kāi)發結核疫苗的融合抗原。有研究表明(míng)Rv3428c重組蛋白(bái)有較高(gāo)的臨床應用(yòng)價值，Rv3428c的重組蛋白(bái)輔助診斷陰性菌的肺結核有81. 5%靈敏度和(hé)82. 0%特異度。
爲進一步探讨Rv3428c在MTB特異性診斷中的研究價值，來(lái)自(zì)四川大(dà)學華西公共衛生學院的研究人員通過同源重組得到(dào)pET28a-Rv3428c表達載體，轉入E. coli BL21( DE3)後進行IPTG誘導表達，用(yòng)Ni-NTA親和(hé)層析純化目的蛋白(bái)。重組蛋白(bái)免疫小(xiǎo)鼠後進行細胞融合，間接ELISA、Western Blot篩選陽性雜(zá)交瘤細胞系，以篩選獲得的陽性雜(zá)交瘤細胞誘導小(xiǎo)鼠産生腹水(shuǐ)，蛋白(bái)A親和(hé)層析法純化抗體，BCA法測定濃度，ELISA和(hé)SDS-PAGE進行單克隆抗體的鑒定及亞型和(hé)效價的測定。
Construction and identification of pET28a－Rv3428c vector
普健生物擁有十餘年的重組蛋白(bái)表達和(hé)雜(zá)交瘤細胞單克隆抗體制備經驗，經過不斷的探索和(hé)改進，開(kāi)發了(le)建立了(le)3H（High through、High efficiency、High quality）大(dà)腸杆菌表達系統，擁有獨特的表達純化及複性平台，95%以上(shàng)的超高(gāo)蛋白(bái)表達成功率，已成功交付上(shàng)萬例大(dà)腸杆菌表達服務項目。如果您有大(dà)腸杆菌重組蛋白(bái)表達與純化項目需求，歡迎聯系027-87001869與我們的專員進行溝通！此外(wài)，普健生物長期爲國内外(wài)科研機構，IVD企業，抗體藥物企業提供抗體發現(xiàn)技術服務，積累豐富的抗體開(kāi)發經驗，可以提供DNA免疫，多肽、蛋白(bái)免疫，小(xiǎo)分子免疫；高(gāo)通量定制化抗體篩選方案；ELISA、WB、IF、IHC、FC、Biacore 等多樣性高(gāo)通量檢測平台以及雜(zá)交瘤測序技術和(hé)重組抗體表達服務。如果您有雜(zá)交瘤抗體制備需求或相關技術咨詢，歡迎聯系027-87001869共同交流探讨！
最終測序結果表明(míng)，插入序列與MTB H37Rv基因組Rv3428c公布的序列一緻，表明(míng)原核表達載體構建成功。對(duì)重組蛋白(bái)進行大(dà)量表達與純化，純化的重組蛋白(bái)使用(yòng)超濾管進行超濾濃縮，SDS－PAGE分析目的蛋白(bái)的表達。
Abundantly expression and purification of pET28a－Rv3428c recombinant protein
随後，通過Western blot篩選出一株效果好(hǎo)的陽性雜(zá)交瘤細胞株，通過體内誘生法制備獲得Rv3428c單克隆抗體。該單抗屬于IgG2a亞類，κ型輕鏈，效價約爲1∶128000，濃度爲4 mg /ml。
Purification and identification of Anti－Rv3428c Monoclonal Antibody
Determination of purified anti－Rv3428c－mAb titer by ELISA
Identification of monoclonal antibody subtypes by ELISA
Identification of Anti-Rv3428c Monoclonal Antibody Subtypes
關于MTB診斷抗原的研究有很(hěn)多，但(dàn)應用(yòng)于檢測抗原的研究相對(duì)比較空(kōng)白(bái)。Rv3428c特異性地在結核分枝杆菌中表達，其他(tā)分枝杆菌中不存在該基因，因此特異性好(hǎo)。這(zhè)項研究成功構建了(le)MTB的RD11區(qū)Rv3428c 表達載體，大(dà)量表達并純化蛋白(bái)，成功制備Rv3428c單克隆抗體。爲後續探索其在臨床樣本中的應用(yòng)價值，爲臨床MTB快(kuài)速抗原檢測試劑盒提供參考，爲尋找早期、方便快(kuài)速、靈敏度高(gāo)、特異性強的診斷方法奠定基礎。
參考文(wén)獻
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