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上(shàng)篇流式小(xiǎo)課堂的第一期，我們帶大(dà)家簡單了(le)解流式檢測平台【第一期】流式小(xiǎo)課堂。從(cóng)本篇開(kāi)始我們将以 step by step 的方式各個擊破關于流式實驗的相關難點。
我們知(zhī)道(dào)流式細胞術是基于特定激光激發下(xià)，細胞産生的熒光被流式儀接收器接收。那麽流式儀所接收的光信号一定就是應該素被激發之後所産生的嗎？答(dá)案是否。這(zhè)裏我們要引入一個概念---非特異性熒光。所謂非特異性熒光是指：細胞表面的某些(xiē)分子或者結構能(néng)夠産生熒光，這(zhè)種熒光相對(duì)于熒光素産生的熒光較弱，并且與細胞表面的特異抗原分子沒有相關性。由于非特異性熒光的存在，在特定激光激發下(xià)，細胞産生的熒光并不是絕對(duì)的有或者無，細胞表面不結合流式熒光素也(yě)會(huì)産生熒光信号。這(zhè)就給我們分析流式結果時(shí)帶來(lái)了(le)一定的難度，相當于我們通過流式檢測時(shí)得到(dào)的熒光信号是細胞本身的非特異性熒光和(hé)來(lái)自(zì)于細胞表面結合的熒光素的特異性熒光疊加得到(dào)的結果。
陰性對(duì)照
由于存在光信号疊加，因此在分析流式結果時(shí)我們需要比較熒光信号與細胞的非特異性熒光。如果得到(dào)的熒光信号大(dà)于非特異性熒光，說明(míng)得到(dào)的熒光信号部分來(lái)源于熒光素的特異性熒光，就可以得出細胞表達相應的抗原分子的結論。所以，确定與熒光素無關的細胞自(zì)身的非特異性熒光的強弱非常重要，設立陰性對(duì)照就是爲了(le)确定細胞的非特異性熒光。
上(shàng)圖爲3類陰性對(duì)照和(hé)标記熒光素偶聯抗體(抗CD69-PE)得到(dào)的熒光信号的示意圖。相比于前面3類陰性對(duì)照，可以得出這(zhè)群樣品細胞中有30％的細胞表達有CD69抗原分子。如果沒有陰性對(duì)照作(zuò)爲參照，直接根據最後标記熒光素偶聯抗體組的熒光信号無法判斷樣品細胞中有多少比例的細胞表面結合有PE熒光素，從(cóng)而也(yě)就無法判斷有多少比例的細胞表達CD69抗原分子。
第1類
negative
“negative”表示的是不加任何熒光素偶聯抗體時(shí)得到(dào)的熒光信号，因爲沒有标記任何熒光素，所以這(zhè)組得到(dào)的熒光信号與熒光素無關，與細胞抗原分子是否表達無關，得到(dào)的熒光信号代表的是非特異性熒光信号；
第2類
抗CD69
“抗CD69”表示的是用(yòng)抗CD69抗體标記樣品細胞後得到(dào)的熒光信号，雖然抗CD69抗體能(néng)夠與細胞表面的CD69抗原分子結合，但(dàn)是抗CD69抗體沒有偶聯熒光素，所以得到(dào)的熒光信号也(yě)與細胞表面是否表達有CD69分子無關，得到(dào)的熒光信号代表的也(yě)隻是細胞本身的非特異性熒光，所以這(zhè)種對(duì)照用(yòng)于排除抗體的影響；
第3類
IgG1-PE
“IgG1-PE”表示的是标記與抗CD69抗體同種屬（來(lái)源于同一物種）且同類（抗CD69-PE中的抗體是IgG1類的）的非特異性抗體（IgG1）與PE熒光素偶聯的同型（isotype）對(duì)照抗體（IgG1-PE）後，得到(dào)的熒光信号，這(zhè)種同型對(duì)照抗體不能(néng)與細胞表面的CD69發生特異性結合，所以細胞表面不會(huì)結合有IgG1-PE，最後得到(dào)的熒光信号不是PE熒光素産生的特異性熒光信号，而是代表細胞本身的非特異性熒光，所以這(zhè)種對(duì)照用(yòng)于排除熒光素的影響。第3類同型對(duì)照抗體就是我們在流式實驗中最常設置的同型對(duì)照。
FMO對(duì)照
減一陰性對(duì)照（Fluorescence-minus-onecontrol，FMO對(duì)照）是一種特殊的陰性對(duì)照，是指在多色（通道(dào)）分析時(shí)對(duì)其中某一個通道(dào)特别設置的陰性對(duì)照，多在研究不同細胞亞群表達某些(xiē)重要的表型分子、細胞因子等時(shí)應用(yòng)。
如需要研究人外(wài)周血單個核細（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中CD62L+CD4+和(hé)CD62L-CD4+兩個細胞亞群表達CD45RA這(zhè)個重要表型分子的表達情況時(shí)，需要同時(shí)标記不同熒光素偶聯的抗人CD4、CD62L和(hé)CD45RA抗體，除了(le)常規的陰性對(duì)照設置，最好(hǎo)再設置一組FMO對(duì)照，就是隻标記熒光素偶聯抗人CD4和(hé)CD62L抗體，而不标記熒光素偶聯的抗人CD45RA抗體，然後将CD62L+CD4+和(hé)CD62L-CD4+細胞亞群分别設門(mén)，将兩群細胞分别顯示于新的散點圖中，散點圖上(shàng)其中一個軸代表CD45RA的熒光信号，這(zhè)時(shí)就可以分别設置這(zhè)兩個細胞亞群CD45RA通道(dào)的陰陽性界線，然後再上(shàng)樣分析實驗組，根據不同細胞亞群各自(zì)的陰陽性界線分别判定細胞亞群各自(zì)表達CD45RA的情況。這(zhè)種特殊的陰性對(duì)照就是FMO對(duì)照。因爲不同細胞亞群的非特異性熒光可能(néng)存在差異，而且不同細胞亞群結合有不同的熒光素偶聯抗體從(cóng)而使它們的最佳補償值存在差異，當在統一的補償條件下(xià)同時(shí)分析時(shí)，不同細胞亞群在某一通道(dào)的陰陽性界線就可能(néng)存在差異，普通陰性對(duì)照無法進一步區(qū)分這(zhè)種差異，而FMO對(duì)照就可以通過隻缺少标記這(zhè)一通道(dào)代表的熒光素偶聯抗體，精确界定不同細胞亞群各自(zì)的這(zhè)一通道(dào)的陰陽性界線，從(cóng)而使流式分析結果更加精确。
陽性對(duì)照
說完了(le)陰性對(duì)照，我們來(lái)講講陽性對(duì)照的設置。流式實驗的陽性對(duì)照，是指在使用(yòng)某種熒光素偶聯抗體前先檢測該熒光素偶聯抗體是否有效。
陽性對(duì)照并不是每次流式分析時(shí)都必須設置，以下(xià)是需要設置陽性對(duì)照的情況，給大(dà)家參考判斷：
1.使用(yòng)新的熒光素偶聯抗體時(shí)，該熒光素偶聯抗體以前沒有使用(yòng)過。
2.換用(yòng)不同公司的或者同一公司但(dàn)不同批号的熒光素偶聯抗體時(shí)。
3.使用(yòng)儲存時(shí)間較長的熒光素偶聯抗體時(shí)。
當出現(xiàn)以上(shàng)三種情況時(shí)，熒光素偶聯抗體會(huì)因爲失效而導緻無法與抗原分子結合産生特異性的熒光信号，從(cóng)而得到(dào)一個假陰性的結果。
設置陽性對(duì)照通常我們使用(yòng)以下(xià)兩種方法：
01
肯定表達有相應抗原分子的樣品細胞來(lái)檢測，如檢測熒光素（不管哪種熒光素）偶聯的抗小(xiǎo)鼠CD4抗體，可以用(yòng)該抗體标記正常小(xiǎo)鼠的脾髒細胞，因爲該細胞内肯定有CD4陽性細胞，而且已知(zhī)CD4陽性細胞占脾髒細胞的大(dà)緻比例範圍，所以如果用(yòng)該抗體标記脾髒細胞得到(dào)意料中的結果時(shí)，就可以認爲該抗體有效；
02
如果實驗室有已證明(míng)有效地與待測熒光素偶聯抗體的單克隆抗體相同但(dàn)偶聯的熒光素不同的熒光素偶聯抗體，如需檢測FITC偶聯的抗小(xiǎo)鼠CD4抗體（FITC-CD4抗體）是否有效，實驗室已有證明(míng)有效的PE偶聯的抗小(xiǎo)鼠CD4抗體（PE-CD4抗體），這(zhè)時(shí)可以用(yòng)這(zhè)兩種熒光素偶聯抗體同時(shí)标記同一份肯定表達有相抗原分子（CD4分子）的樣品細胞，流式檢測後如果PE陽性的細胞FITC也(yě)是陽性的，PE陰性的細胞FITC也(yě)是陰性的，就可以證明(míng)該待測的熒光素偶聯抗體有效。
以上(shàng)就是關于流式實驗中對(duì)照設置的相關知(zhī)識，下(xià)一篇我們将繼續介紹流式實驗如何選擇流式細胞術常用(yòng)的熒光素。敬請(qǐng)期待~
關于普健
普健生物（AtaGenix）于2012年在武漢成立，作(zuò)爲武漢國家生物産業基地公共服務平台—光谷抗體發現(xiàn)與篩選公共服務平台。普健生物（AtaGenix）專注于重組蛋白(bái)、抗體、診斷原料、抗體藥物發現(xiàn)等自(zì)主技術平台的建設和(hé)下(xià)遊生物醫(yī)藥産品的戰略合作(zuò)。經過10年的發展，普健生物已成爲一家立足武漢，業務覆蓋全國、輻射全球的高(gāo)新技術服務企業。目前公司擁有4200平米自(zì)建實驗室（包含800平高(gāo)标準BSL-2級細胞房），擁有齊全蛋白(bái)抗體開(kāi)發設備500餘套，包括高(gāo)通量蛋白(bái)純化儀、Agilent 流式細胞分析儀，全自(zì)動HPLC分析儀，openSPR蛋白(bái)、抗體親和(hé)力測定儀，Olympus熒光顯微鏡， BTX電融合儀，微生物發酵罐，中試型高(gāo)壓均質機，全自(zì)動管式化學發光儀，以及配套的高(gāo)速離心機，細胞計(jì)數儀及大(dà)容量細胞培養搖床。公司先後獲得榮譽：3551人才計(jì)劃、高(gāo)新技術企業、技術先進型服務企業、光谷瞪羚企業
