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很(hěn)多人不知(zhī)道(dào)，抗體藥物研發，最關鍵的一步是。。。
咨詢，問對(duì)人很(hěn)重要
一個雙特異性抗體藥與普健的故事(shì)，四年征程，未完待續。。。
那是風(fēng)和(hé)日麗(lì)的一個下(xià)午，叮咚~
一條消息跳了(le)出來(lái)，“要開(kāi)發雙特異性抗體藥物，你(nǐ)們有專家嗎？”
“我們的抗體藥物專家經驗豐富，曾經成功開(kāi)發過上(shàng)市治療性抗體藥物，可以針對(duì)具體需求進行個性化設計(jì)。AtaGenix将全程爲您服務。”
随後，一項曆時(shí)四年的工(gōng)程由此展開(kāi)。
目标：開(kāi)發一種雙特異性抗體藥物，通過連接CD3抗體，增強針對(duì)某類特定腫瘤細胞A的免疫系統識别能(néng)力。
要開(kāi)發雙特異性抗體，我們得先分别獲得抗單種抗原的鼠單抗---CD3抗體和(hé)腫瘤抗原A的抗體。然後進行雙特異性抗體設計(jì)、表達及純化，對(duì)正确組裝後的雙抗進行檢測，最終實現(xiàn)大(dà)規模生産。
路得一步一步走，每一步都很(hěn)關鍵。
這(zhè)就需要我們的單克隆抗體開(kāi)發技術（點擊可查看(kàn)技術詳情）。
已知(zhī)目标蛋白(bái)在哺乳動物表達系統裏很(hěn)難表達，但(dàn)我們就是解決困難的。
接下(xià)來(lái)，沿着單克隆抗體開(kāi)發流程，看(kàn)一下(xià)我們是怎樣做到(dào)的。
經過預測和(hé)評估，我們選擇了(le)目标蛋白(bái)的一個片段在哺乳動物細胞中進行表達。
雖然，該基因是針對(duì)哺乳動物細胞表達而設計(jì)和(hé)優化的。
但(dàn)是，我們向來(lái)不隻做單一準備，永遠備有爲客戶準備的Plan B。So，除了(le)哺乳動物細胞表達系統，我們還選了(le)大(dà)腸杆菌作(zuò)爲備用(yòng)系統。兩種表達方案同時(shí)進行，最終獲得滿足條件的抗原。
用(yòng)原始抗原免疫五隻小(xiǎo)鼠，并篩選陽性血清。
爲了(le)篩選到(dào)符合要求的抗體，我們将綠色熒光蛋白(bái)GFP與抗原蛋白(bái)在哺乳動物細胞中融合表達，通過FITC信号将表達GFP的細胞篩選出來(lái)，作(zuò)爲流式分析抗體特異性的陽性細胞；并使用(yòng)能(néng)夠識别GFP的一抗作(zuò)爲陽性抗體對(duì)照，來(lái)篩選特異性抗體。
流式分析檢測結果(GFP抗體和(hé)GFP陽性細胞百分比)：
流式檢測中對(duì)抗原免疫原性最強的爲3号小(xiǎo)鼠血清，4号次之，我們決定對(duì)小(xiǎo)鼠3号和(hé)4号進行融合。
将篩選出的兩隻小(xiǎo)鼠脾細胞分别進行融合、亞克隆，FC檢測保留最佳陽性抗體，最終獲得最佳的30株抗腫瘤抗原A候選單克隆抗體雜(zá)交瘤細胞株。
看(kàn)一下(xià)我們都做了(le)哪些(xiē)工(gōng)作(zuò)☟
a. 對(duì)3号小(xiǎo)鼠細胞融合後的上(shàng)清，進行ELISA檢測，從(cóng)中篩選出42株陽性細胞株（下(xià)表）。
b. 對(duì)3号小(xiǎo)鼠細胞融合後的上(shàng)清，進行FC檢測，從(cóng)中篩選出14株陽性細胞株（下(xià)表）。
c. 生産的抗體，進行FC檢測，從(cóng)中篩選出30株陽性細胞株（下(xià)表）。
小(xiǎo)結
經過多系統表達測試，我們成功地在哺乳動物細胞中重組表達了(le)目标抗原，開(kāi)發出對(duì)抗原具有良好(hǎo)親和(hé)力和(hé)特異性的單克隆抗體。最終，我們生産并純化得到(dào)了(le)30株抗腫瘤抗原A抗體的單克隆細胞株，産生的抗體均可以在流式細胞術中成功識别抗原。
抗腫瘤抗原A雜(zá)交瘤測序獲得鼠單抗的VH和(hé)VL序列。
做了(le)8個嵌合抗體的表達純化，将8個嵌合抗體和(hé)1個原始雜(zá)交瘤細胞純化得到(dào)的抗體進行ELISA驗證，用(yòng)Biacore檢測了(le)這(zhè)9個抗體的親和(hé)力，篩選到(dào)了(le)高(gāo)親和(hé)力的嵌合抗體。
表達了(le)18個人源化抗體，将18個人源化抗體、原始雜(zá)交瘤細胞純化得到(dào)的抗體及篩選得到(dào)的最佳嵌合抗體，進行ELISA驗證，用(yòng)Biacore檢測了(le)這(zhè)20個抗體的親和(hé)力，篩選得到(dào)高(gāo)親和(hé)力抗體。
接下(xià)來(lái)，是最關鍵的一步。别眨眼哦！
目标：抗腫瘤抗原A和(hé)CD3的雙特異性抗體
我們已獲得3個抗腫瘤抗原A抗體，1個抗CD3抗體。
AB1（前期項目中開(kāi)發并測序的小(xiǎo)鼠雜(zá)交瘤單克隆抗體）
AB2和(hé)AB3（通過噬菌體展示開(kāi)發的人源單克隆抗體）
AB4 （AB4h）是在專利中公開(kāi)的的抗CD3人源化抗體
我們的抗體設計(jì)專家設計(jì)了(le)3種類型的雙特異性抗體，即CrossMAb，IgG-like format using DuoBodies，and IgG-like bivalent Fab-Fab-Fc format。
将cDNA序列亞克隆到(dào)AtaGenix特有的哺乳動物細胞表達載體pTXs1中，本項目共使用(yòng)21個表達質粒（下(xià)表）：
總共16種抗腫瘤抗原A和(hé)抗CD3的重組抗體片段用(yòng)于測試。
表達測試結果如下(xià)：
CrossMAbs類型重組抗體表達純化測試
結果表明(míng)，CrossMAbs是表達的，但(dàn)沒有以完整的雙特異性抗體結構組裝，處于半形成狀态。
DuoBodies類型重組抗體表達純化測試
No.7: AB1重組抗體；No.8: AB2重組抗體；No.9: AB3重組抗體；No./10: AB4重組抗體
Bivalent Fab-Fab類型重組抗體表達純化測試
重組抗體QC結果（還原膠和(hé)非還原膠）
結果顯示，對(duì)于DuoBodies和(hé)Bivalent Fab-Fab抗體類型，正确地産生了(le)完整的雙特異性抗體結構。
值得一提的是，我們整個表達純化過程對(duì)内毒素進行了(le)有效的控制和(hé)去除，将内毒素控制在<0.1EU/mg。
上(shàng)面獲得的DuoBodies類型重組抗體，目前隻能(néng)特異識别單一抗體，如何将兩種抗體組合連接，就需要神奇的Fab臂交換技術。
通過特定的條件，進行Fab臂交換重組抗腫瘤抗原A抗體和(hé)抗CD3抗體，形成雙特異性抗體。
對(duì)交換重組的雙特異性抗體進行檢測：
重組DuoBodies抗體QC結果（還原膠和(hé)非還原膠）
1：No.7+No./10；2：No.8+No./10；3：No.9+No./10
重組DuoBodies抗體産量及純度
5.1）SEC-HPLC Analysis
SEC-HPLC檢測結果表明(míng)，No.7+No./10重組雙特異性抗體濃度最高(gāo)，是由兩個重鏈和(hé)兩個輕鏈組成的理(lǐ)想雜(zá)合四聚體。No.8+No./10重組抗體有一些(xiē)降解或未組裝完全，No.9+No./10重組抗體顯著降解或組裝較少。
5.2）ELISA滴定
ELISA滴定法同時(shí)測定雙特異性抗體和(hé)以前獲得的親本抗體(AB1、AB2和(hé)AB3)對(duì)腫瘤抗原A和(hé)CD3的結合能(néng)力。
針對(duì)腫瘤抗原A結合檢測
針對(duì)CD3結合檢測
檢測結果顯示，所有陽性對(duì)照與預期一緻。
DuoBodies和(hé)Bivalent Fab-Fab抗體與腫瘤抗原A和(hé)CD3結合良好(hǎo)，說明(míng)這(zhè)兩類重組雙特異性抗體構建正确。雖然CrossMAbs類型抗體也(yě)會(huì)結合，但(dàn)它們的結合很(hěn)可能(néng)是由半合成狀态的抗體造成的。
項目的順利推動，其中包含2000多封郵件溝通，30多個技術人員辛勤實驗，曆時(shí)4年，中法科學家通力合作(zuò)。
目前，其中一個雙特異性抗體已經完成開(kāi)發，生産并交付客戶1.237g抗體。接下(xià)來(lái)，客戶計(jì)劃采用(yòng)我們擁有自(zì)主知(zhī)識産權的細胞株進行穩定細胞株構建，後續事(shì)宜正在商定中。
