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| 種類 | 研究對(duì)象 | 結合技術 |
|---|---|---|
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染色質免疫沉澱 (CHIP) |
DNA-蛋白(bái)質 | PCR |
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蛋白(bái)質免疫沉澱 (PIP) |
抗原-抗體 | 蛋白(bái)免疫印迹 |
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放(fàng)射免疫沉澱 (RIP) |
抗原-抗體 | 放(fàng)射性同位素技術 |
當然，再結合其他(tā)技術還可以衍生出更多的技術，本篇先來(lái)剖析一下(xià)染色質免疫沉澱（CHIP）。
染色質免疫沉澱 (ChIP) 是研究體内DNA與蛋白(bái)質相互作(zuò)用(yòng)的方法。其原理(lǐ)是在活細胞狀态下(xià)固定蛋白(bái)質-DNA複合物，并将其随機切斷爲一定長度範圍内的染色質小(xiǎo)片段，然後通過免疫學方法沉澱此複合體，特異性地富集目的蛋白(bái)結合的DNA片段。後期通過對(duì)目的片斷的純化與檢測，從(cóng)而獲得蛋白(bái)質與DNA相互作(zuò)用(yòng)的信息。
應用(yòng)：ChIP可以用(yòng)來(lái)檢測體内反式作(zuò)用(yòng)因子與DNA的動态作(zuò)用(yòng)，還可以用(yòng)來(lái)研究組蛋白(bái)的各種共價修飾與基因表達的關系。而且，ChIP與其他(tā)方法的結合擴大(dà)了(le)其應用(yòng)範圍：ChIP與基因芯片相結合建立的ChIP-on-chip方法已廣泛用(yòng)于特定反式因子靶基因的高(gāo)通量篩選；ChIP與體内足迹法相結合，用(yòng)于尋找反式因子的體内結合位點；RNA-ChIP用(yòng)于研究RNA在基因表達調控中的作(zuò)用(yòng)。
甲醛處理(lǐ)細胞
收集細胞，超聲破碎
加入目的蛋白(bái)的抗體，與靶蛋白(bái)-DNA複合物相互結合
加入ProteinA，結合抗體-靶蛋白(bái)-DNA複合物，沉澱
對(duì)沉澱下(xià)來(lái)的複合物進行清洗，除去一些(xiē)非特異性結合
洗脫，得到(dào)富集的靶蛋白(bái)-DNA複合物
解交聯，純化富集的DNA-片斷
PCR或基因芯片分析
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翹首以待實驗成果
然後有人歡喜有人憂
怎麽把“驚吓”變成“驚喜”
this is a question
隻要找到(dào)破解方法，
所有的問題都不是問題！
今天我們就來(lái)一一擊破
免疫沉澱系列實驗中那些(xiē)揪心的問題。
| 原因 | 方案 |
|---|---|
| 洗滌不充分 | 離心前蓋上(shàng)管蓋反複颠倒幾次 |
| 抗體濃度太高(gāo) | 檢查推薦抗體用(yòng)量，嘗試使用(yòng)更少的抗體 |
| 抗體特異性不夠 | 使用(yòng)親和(hé)純化的抗體，最好(hǎo)預先吸收 |
| 封閉不充分 | 優化封閉時(shí)間/溫度，室溫封閉1小(xiǎo)時(shí)或4℃封閉過夜 |
| 封閉液中與其他(tā)蛋白(bái)發生抗體的交叉反應 | 換一種不同的封閉液；不要用(yòng)含抗生素蛋白(bái)的牛奶封閉，牛奶含生物素 |
| 操作(zuò)設備被污染 | 保證電泳儀器、印迹儀器和(hé)孵育用(yòng)容器清潔，無外(wài)源污染物 |
| 原因 | 方案 |
|---|---|
| 蛋白(bái)未轉到(dào)膜上(shàng) | 可以用(yòng)麗(lì)春紅(hóng)染膜并結合染膠（考馬斯亮(liàng)藍）後确定條帶是否轉至膜上(shàng)或轉移過頭；适當調整轉膜的時(shí)間和(hé)電流 |
| 一抗、二抗等不匹配 | 選擇針對(duì)一抗來(lái)源的種屬抗體 |
| 過度封閉 | 使用(yòng)含0.5%脫脂奶粉或無脫脂奶的抗體稀釋液；試用(yòng)不同的封閉液；減少封閉時(shí)間 |
| 洗膜過度 | 洗膜時(shí)間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議(yì)使用(yòng)0.05%的弱去垢劑Tween-20 |
| 曝光時(shí)間太短 | 延長膠片的曝光時(shí)間，超感應化學發光底物會(huì)持續發光至少6個小(xiǎo)時(shí) |
| 原因 | 方案 |
|---|---|
| 細胞傳代次數過多，蛋白(bái)表達模式分化 | 使用(yòng)原始或傳代少的細胞株或進行平行實驗 |
| 樣本處理(lǐ)過程中目的蛋白(bái)發生降解 |
使用(yòng)新鮮制備的标本并使用(yòng)蛋白(bái)酶抑制劑；樣本處理(lǐ)時(shí)在冰上(shàng)操作(zuò) |
| 一抗不純 | 使用(yòng)單克隆或親和(hé)純化的抗體，減少非特異條帶 |
| 一抗特異性不高(gāo) | 重新選擇或制備高(gāo)特異性的抗體 |
如果你(nǐ)的WB實驗出現(xiàn)了(le)這(zhè)些(xiē)問題，
這(zhè)些(xiē)方案供你(nǐ)參考，
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問題多，方法更多。
小(xiǎo)編更希望你(nǐ)們實驗開(kāi)挂，這(zhè)些(xiē)問題統統木(mù)有！
