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蛋白(bái)表達問題一直備受關注，如何實現(xiàn)蛋白(bái)高(gāo)效表達這(zhè)個老(lǎo)生常談的話(huà)題，今天還是要跟你(nǐ)們探讨一下(xià)。
影響蛋白(bái)表達的因素主要有：
這(zhè)個是很(hěn)多克隆新人常犯的錯誤，在克隆時(shí)弄錯讀碼框，從(cóng)而導緻蛋白(bái)不表達。蛋白(bái)表達載體構建正确是蛋白(bái)表達實驗的基礎，構建載體時(shí)要考慮啓動子、多克隆位點、終止子、融合标簽、複制子等多種因素。
不同宿主菌的基因型不同，選擇合适的宿主菌對(duì)某些(xiē)特殊的載體進行蛋白(bái)表達至關重要。有時(shí)表達重組的毒素蛋白(bái)，對(duì)宿主細胞也(yě)有毒性，會(huì)造成質粒丢失。
不同物種間基因組的GC含量有顯著差異，GC含量通常間接對(duì)基因表達進行調控和(hé)影響，超過70%可能(néng)會(huì)減低(dī)蛋白(bái)表達水(shuǐ)平。
（1）密碼子偏愛性
不同物種的基因在密碼子使用(yòng)上(shàng)存在着明(míng)顯的偏愛性，甚至同物種内不同功能(néng)的基因其密碼子使用(yòng)頻率也(yě)存在較大(dà)的差異，密碼子偏愛性對(duì)重組蛋白(bái)的表達具有深刻複雜(zá)的影響。
密碼子的偏愛性是通過控制可用(yòng)tRNA豐度影響蛋白(bái)的翻譯過程，tRNA的缺乏可能(néng)導緻對(duì)應的稀有密碼子在蛋白(bái)表達過程中使翻譯速率降低(dī)甚至終止，從(cóng)而使蛋白(bái)水(shuǐ)平顯著降低(dī)。
（2）密碼子的使用(yòng)頻率低(dī)。
某些(xiē)基因本身含稀有密碼子，擁有所用(yòng)宿主的稀有密碼子越多的基因，越難在該宿主中表達出理(lǐ)想水(shuǐ)平的重組蛋白(bái)。可選用(yòng)高(gāo)頻使用(yòng)的密碼子替代基因中存在的已選宿主的稀有密碼子，或在排除原始基因中的稀有密碼子的基礎上(shàng)進行重新合成，同時(shí)使密碼子組成頻率更接近宿主。
但(dàn)是研究表明(míng)，密碼子的優化必須與蛋白(bái)的高(gāo)級結構聯系起來(lái)，如果通過一味地替換稀有密碼子來(lái)提高(gāo)重組蛋白(bái)的表達可能(néng)會(huì)起到(dào)适得其反的結果。
mRNA如果形成大(dà)而穩定的二級結構如發卡結構和(hé)莖環結構，尤其是起始密碼子附近的穩定二級結構，将會(huì)影響mRNA在翻譯過程中核糖體的結合和(hé)延伸，從(cóng)而降低(dī)翻譯的效率和(hé)最終的蛋白(bái)表達水(shuǐ)平。
如果序列裏有和(hé)核糖體結合位點/或翻譯起始位點互補的序列，由此形成的mRNA二級結構，會(huì)讓翻譯嘎然而止，此時(shí)就需要進行同義密碼子替換。
因此，合理(lǐ)優化翻譯起始區(qū)的mRNA二級結構，将有效提高(gāo)目的蛋白(bái)表達水(shuǐ)平。
蛋白(bái)的表達調控分爲轉錄水(shuǐ)平和(hé)翻譯水(shuǐ)平，一般來(lái)說，轉錄水(shuǐ)平起關鍵作(zuò)用(yòng)，但(dàn)同時(shí)翻譯的效率與mRNA的降解直接相關，因此，也(yě)間接影響着轉錄後水(shuǐ)平的調控。原核表達中，存在稀有密碼子的mRNA翻譯過程受到(dào)影響，使得mRNA得不到(dào)更多核糖體結合後的有效保護，也(yě)将導緻mRNA的降解從(cóng)而使蛋白(bái)積累水(shuǐ)平顯著降低(dī)。
堿基的缺失、插入或突變，都會(huì)對(duì)翻譯的蛋白(bái)産生影響，在PCR擴增時(shí)，堿基序列突變爲終止密碼子，會(huì)導緻蛋白(bái)翻譯意外(wài)終止。所以在進行表達之前，通常要進行測序來(lái)避免這(zhè)種情況的發生。
當然，影響蛋白(bái)表達的其他(tā)要素或優化方法，還包括檢查單核苷酸重複和(hé)密碼子重複，起始密碼子環境，終止密碼子及其環境，避免内含子、AT 富含區(qū)、内部核糖體進入位點 (IRES)、重組位點等不利元件，選擇合适的 UTR 序列和(hé)信号肽序列，合理(lǐ)設計(jì)酶切位點、接頭、融合基因、檢測和(hé)純化标簽等。其他(tā)影響蛋白(bái)表達因素，歡迎大(dà)神補充。
