别問蛋白(bái)有多少，掌握定量方法再來(lái)說

發表時(shí)間：2023-02-27 訪問次數：246

蛋白(bái)定量

蛋白(bái)定量即蛋白(bái)質定量，蛋白(bái)質定量根據其目的分爲蛋白(bái)質的“總定量”和(hé)特定蛋白(bái)質的“個别定量”。蛋白(bái)定量是生物學實驗不可缺少的一部分，爲驗證細胞裂解是否成功，或爲了(le)将多個樣品進行平行實驗比較或标準化保存，需對(duì)細胞裂解液進行蛋白(bái)定量；爲了(le)判定蛋白(bái)的産量，需對(duì)純化好(hǎo)的蛋白(bái)進行定量；爲了(le)将純化好(hǎo)的蛋白(bái)用(yòng)生物素或報(bào)告酶進行标記，同樣需要首先對(duì)蛋白(bái)樣品進行定量，以保證标記反應在适當的化學濃度下(xià)進行。

蛋白(bái)質是一種十分重要的生物大(dà)分子，它種類繁多，結構不一，功能(néng)各異，分子量相差很(hěn)大(dà)，因此建立一個理(lǐ)想而又通用(yòng)的蛋白(bái)質定量分析方法很(hěn)因難。

現(xiàn)測定蛋白(bái)質含量的方法有很(hěn)多：根據物理(lǐ)性質來(lái)分有紫外(wài)分光光度法；根據化學性質來(lái)分有凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法（Lowary法）、BCA法和(hé)膠體金(jīn)法；根據染色性質有考馬斯亮(liàng)藍染色法、銀染法；根據其他(tā)性質有熒光法；其中較爲常見的有以下(xià)五種。

紫外(wài)分光光度法

蛋白(bái)質分子中含有共轭雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸具有吸收紫外(wài)光的性質，其吸收高(gāo)峰在280 nm波長處，且在此波長内吸收峰的光密度值與蛋白(bái)濃度成正比，故可作(zuò)爲蛋白(bái)質定量測定的依據。該方法是最快(kuài)的蛋白(bái)質定量方法，但(dàn)由于各種蛋白(bái)質中酪氨酸和(hé)色氨酸含量不同，如要準确定量則應有待測蛋白(bái)質的純品作(zuò)爲标準來(lái)比較，或者知(zhī)道(dào)其消光系數作(zuò)爲參考。另外(wài)，不少雜(zá)質在280 nm波長下(xià)也(yě)有—定吸收能(néng)力，可能(néng)發生幹擾，其中核酸(嘌呤和(hé)嘧啶)的影響尤爲嚴重。核酸的最大(dà)吸收峰是在260 nm，因此若溶液中存在核酸，必須同時(shí)測定OD₂₆₀與OD₂₈₀_，然後根據兩種波長的吸收度比值，通過經驗公式校正，以消除核酸的影響而推算(suàn)出蛋白(bái)質的真實含量。

優點

操作(zuò)簡便迅速，且不消耗樣品(可以回收)，多用(yòng)于純化蛋白(bái)質的微量測定。

缺點

（1）當待測的蛋白(bái)質與标準蛋白(bái)質中的酪氨酸和(hé)色氨酸含量差異較大(dà)時(shí)，會(huì)産生—定誤差。

（2）混有核酸時(shí)必須分别測定280 nm和(hé)260 nm兩處的OD值，再按公式推算(suàn)蛋白(bái)質含量。

雙縮脲法

雙縮脲（NH₃CONHCONH₃）是兩個分子脲經180℃左右加熱放(fàng)出一個分子氨後得到(dào)的産物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO₄形成紫色絡合物，稱爲雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能(néng)通過一個中間碳原子相連的肽鍵，這(zhè)類化合物都有雙縮脲反應。紫色絡合物顔色的深淺與蛋白(bái)質濃度成正比，而與蛋白(bái)質分子量及氨基酸成分無關，故可用(yòng)來(lái)測定蛋白(bái)質含量。測定範圍爲1-10 mg蛋白(bái)質。幹擾這(zhè)一測定的物質主要有硫酸铵、Tris緩沖液和(hé)某些(xiē)氨基酸等。

優點

較快(kuài)速，不同的蛋白(bái)質産生顔色的深淺相近，以及幹擾物質少。

缺點

靈敏度差，常用(yòng)于需要快(kuài)速但(dàn)并不需要十分精确的蛋白(bái)質測定。

考馬斯（Comessie)亮(liàng)蘭結合法

考馬斯亮(liàng)蘭結合法是近年來(lái)發展起來(lái)的蛋白(bái)質定量測定法。考馬斯亮(liàng)蘭能(néng)與蛋白(bái)質的疏水(shuǐ)區(qū)相結合，這(zhè)種結合具有高(gāo)敏感性，考馬斯亮(liàng)蘭G250 的最大(dà)光吸收峰在465 nm，當它與蛋白(bái)質結合形成複合物時(shí)，其最大(dà)吸收峰變爲595 nm。在一定範圍内，考馬斯亮(liàng)蘭G250-蛋白(bái)質複合物呈青色。在595 nm下(xià)，光密度與蛋白(bái)質含量呈線性關系。故可以用(yòng)于蛋白(bái)質含量的測定。

優點

（1）操作(zuò)簡便、快(kuài)速；檢測靈敏；重複性好(hǎo)。

（2）顯色迅速，約2分鐘(zhōng)内可完成染料與蛋白(bái)質的結合，所現(xiàn)顔色至少在1小(xiǎo)時(shí)内是穩定的。

（3）與改良Lowary法相比，幹擾物質較少。

缺點

（1）當樣品中存在較大(dà)量的SDS、TritonX-100等去垢劑時(shí)，顯色反應會(huì)受到(dào)幹擾。如樣品緩沖液呈強堿性時(shí)也(yě)會(huì)影響顯色，故必須預先處理(lǐ)樣品。

（2）考馬斯亮(liàng)蘭G250染液不宜久存，以1-2月爲宜。

Lowary蛋白(bái)定量法

Lowary法是雙縮脲法和(hé)福林(lín)酚法的結合與發展，其原理(lǐ)是：蛋白(bái)質溶液用(yòng)堿性銅溶液處理(lǐ)，形成銅-蛋白(bái)質的絡合鹽，在加入酚試劑後，除使肽鏈中酪氨酸、色氨酸和(hé)半胱氨酸等顯色外(wài)，還使雙縮脲法中肽鍵、堿性銅的顯色效果更強烈。因此，Lowary法的顯色效果比單獨使用(yòng)酚試劑強烈3-15倍，爲雙縮脲法的100倍。由于肽鍵顯色效果增強，從(cóng)而減小(xiǎo)了(le)因蛋白(bái)質種類引起的偏差。

注意事(shì)項

（1）酚試劑隻在酸性條件穩定，故當其加到(dào)堿性的銅-蛋白(bái)質溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷钼酸-磷鎢酸試劑被破壞前，還原反應即能(néng)發生。

（2）爲了(le)保證反應進行完全，反應在25～30℃水(shuǐ)浴中進行，反應30 min後準時(shí)比色。

（3）避免還原物質幹擾本實驗。

優點

微克級高(gāo)靈敏度定量測定，穩定。

缺點

（1）受植物體内存在的酚類物質幹擾。

（2）去污劑如TritonX-100，SDS，NP-40的濃度超過0.2%時(shí)會(huì)影響定量結果。

BCA法

BCA( Bicinchoninic acid)法是近來(lái)廣爲應用(yòng)的蛋白(bái)定量方法。其原理(lǐ)與Lowary法蛋白(bái)定量相似，即在堿性環境下(xià)蛋白(bái)質與Cu²⁺絡合并将Cu²⁺還原成Cu¹⁺。BCA與Cu¹⁺結合形成穩定的紫藍色複合物，在562 nm處有高(gāo)的光吸收值并與蛋白(bái)質濃度成正比，據此可測定蛋白(bái)質濃度。

BCA蛋白(bái)定量法需要兩種試劑：

試劑A：稱取1 g sodium bicinchoninate，2 g Na₂CO₃，0.16 g酒石酸鈉，0.4 g NaOH和(hé)0.95 g NaHCO₃，定容到(dào)100 ml，用(yòng)NaOH将pH調到(dào)11.25。

試劑B：将0.4 g CuSO₄•5H₂O溶于10 ml水(shuǐ)中。

工(gōng)作(zuò)液：100份試劑A和(hé)2份試劑B混合。

測量方法：取25 μl 标準品加入到(dào)200 μl BCA工(gōng)作(zuò)液中，37℃或60 ℃孵育30 min，檢測562 nm處的吸光度繪制标準曲線。用(yòng)同樣的方法檢測蛋白(bái)樣品的吸光度可算(suàn)出蛋白(bái)樣品的濃度。

優點

（1）靈敏度高(gāo)，檢測濃度下(xià)限達到(dào)25 μg/ml，最小(xiǎo)檢測蛋白(bái)量達到(dào)0.5 μg，待測樣品體積爲1-20 μl。

（2）操作(zuò)簡單，快(kuài)速，45分鐘(zhōng)内完成測定，比經典的Lowary法快(kuài)4倍且更加方便。

（3）測定蛋白(bái)濃度不受絕大(dà)部分樣品中的去污劑等化學物質的影響，可以兼容樣品中高(gāo)達5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。

（4）在20-200 μg/ml濃度範圍内有良好(hǎo)的線性關系。

（5）檢測不同蛋白(bái)質分子的變異系數遠小(xiǎo)于考馬斯亮(liàng)藍蛋白(bái)定量法。

（6）經濟實用(yòng)，除試管外(wài)，測定可在微闆孔中進行，大(dà)大(dà)節約樣品和(hé)試劑用(yòng)量。

缺點

受螯合劑和(hé)略高(gāo)濃度的還原劑（EDTA小(xiǎo)于10 mM，DTT小(xiǎo)于1 mM，巯基乙醇低(dī)于1mM）的影響。

以上(shàng)是針對(duì)全蛋白(bái)質的“總定量法”，然而許多實驗需要對(duì)溶液中特定蛋白(bái)進行定量分析，即針對(duì)特定蛋白(bái)質的“個别定量”。針對(duì)特定蛋白(bái)定量常用(yòng)的方法有酶聯免疫吸附試驗法（ELISA），免疫印迹分析法（WB）和(hé)質譜檢測（MS）。

ELISA

ELISA是溶液中特定蛋白(bái)定量的一種常用(yòng)方法，通常是在96孔闆上(shàng)進行，關鍵步驟是特定抗原/蛋白(bái)的固定。具體來(lái)說，ELISA有不同變種。

直接或間接ELISA

特定抗原/蛋白(bái)直接吸附到(dào)檢測闆，封閉未被抗原包被的孔闆表面，然後在孔闆中加入酶标（直接ELISA）或未酶标（間接ELISA）的第一抗體，在測試孔闆中，一抗與抗原/蛋白(bái)相結合。對(duì)于未酶标的第一抗體，加入酶标的第二抗體與第一抗體結合。最後，加入酶底物（通常是四甲基聯苯胺TMB或堿性磷酸酶ALP）使溶液發生顔色變化然後使用(yòng)分光光度計(jì)檢測。顔色變化與蛋白(bái)質濃度是直接相關的。

直接ELISA的優點是速度快(kuài)，并且沒有第二抗體的交叉反應問題，但(dàn)局限是第一抗體的标記可能(néng)是費時(shí)和(hé)昂貴的。此外(wài)，信号放(fàng)大(dà)是最弱的。因此，更常用(yòng)的是

夾心ELISA

特定抗原/蛋白(bái)結合在孔闆表面包被的第一抗體（捕獲抗體）和(hé)酶标的第二抗體（檢測抗體）之間，第二抗體比較容易買到(dào)，但(dàn)可能(néng)會(huì)發生第二抗體的交叉反應。

任何ELISA測定蛋白(bái)質濃度的一個重要環節都是蛋白(bái)質标準曲線，通常是連續稀釋已知(zhī)濃度的蛋白(bái)質，從(cóng)而繪制标準曲線。

WB隻能(néng)半定量。通過凝膠電泳把原始或變性的蛋白(bái)質分開(kāi)，把蛋白(bái)質轉膜（硝酸纖維素或PVDF），然後使用(yòng)特定的酶标抗體檢測。最後，加入适當的底物（化學發光底物）産生可檢測的信号。雖然WB比ELISA更費時(shí)，但(dàn)是WB不僅可以對(duì)特定的蛋白(bái)進行定量，而且可以在實驗中同時(shí)檢測蛋白(bái)質修飾。

MS是蛋白(bái)質定量的新興方法。在蛋白(bái)質組學分析中，除了(le)蛋白(bái)定性之外(wài)，一個重要的步驟就是對(duì)特定的蛋白(bái)進行定量分析。MS定量蛋白(bái)的方法有很(hěn)多。

常用(yòng)的方法是較重的穩定同位素碳（¹³C）或氮（¹⁵N）加入到(dào)第一個樣本（多肽或蛋白(bái)質），而相應的輕同位素（¹²C和(hé)¹⁴N）加入到(dào)第二個樣本（内标），然後混合這(zhè)兩個樣本進行分析。由于兩個樣本的質量差，用(yòng)質譜分析儀測定的兩個樣本峰強度的比值就相當于其相對(duì)豐度比。
質譜蛋白(bái)定量的第二種方法，可以不用(yòng)标記樣本，即用(yòng)基質輔助激光解吸/電離 - MALDI分析。

使用(yòng)質譜這(zhè)種通用(yòng)方法可以在一次實驗中同時(shí)進行定量和(hé)定性檢測。但(dàn)這(zhè)種方法需要的檢測儀器很(hěn)昂貴，從(cóng)而限制了(le)該方法的使用(yòng)。

總之，雖然測定蛋白(bái)質含量的方法很(hěn)多，但(dàn)還沒有一個完美(měi)的方法。在選擇測定方法時(shí)，可根據實驗要求和(hé)實驗室條件決定。