利用(yòng)Single B方法快(kuài)速制備高(gāo)效BSA抗體對(duì)的策略

研究背景

殘餘牛血清白(bái)蛋白(bái)（BSA）含量檢測是生物制品質量控制的一項重要指标，直接關系到(dào)生物制品的使用(yòng)安全。世界衛生組織及世界各國藥典對(duì)殘餘BSA含量均有嚴格限定。《中國藥典》（三部）2020版規定，成品中牛血清白(bái)蛋白(bái)殘留量不得>50ng/劑。因此，需要利用(yòng)特異性好(hǎo)，靈敏度高(gāo)的抗體建立一種簡便、高(gāo)效的牛血清白(bái)蛋白(bái)殘留量檢測方法。

客戶痛點

牛血清廣泛使用(yòng)于生物制品研究、制備過程中，雖然在生産過程中經純化可以去除制品中大(dà)部分BSA,但(dàn)微量BSA依然存在于生物制劑成品中。在人體中，超過一定濃度的BSA易引起人的免疫病理(lǐ)反應，引起嚴重的副作(zuò)用(yòng)，影響生物制品的安全性。普健生物基于客戶需求，對(duì)BSA有更爲嚴苛的控制标準，此前我們基于鼠抗開(kāi)發平台開(kāi)發出靈敏度爲0.51ng/ml，可檢測1.56-100ng/mL的BSA檢測試劑盒。能(néng)滿足現(xiàn)行藥典規範BSA殘留檢測要求，并有了(le)穩定的客戶群體。但(dàn)在後續的産品回訪中，我們的項目經理(lǐ)進一步了(le)解了(le)客戶的項目對(duì)BSA殘留其實有更爲嚴苛的控制标準，隻是苦于市售産品檢測限以及靈敏度未能(néng)完全滿足。普健生物技術團隊深挖客戶需求，結合普健生物最新推出的Xten^TMMab兔單克隆抗體開(kāi)發技術，爲客戶提供了(le)一種全新、高(gāo)效、高(gāo)靈敏度的BSA檢測解決方案。

普健全新解決方案

本公司利用(yòng)兔單B細胞抗體開(kāi)發技術，從(cóng)BSA免疫的兔外(wài)周血中，分離BSA特異性的單B細胞，通過PCR 擴增及測序分析，獲得多個特異性識别BSA蛋白(bái)的抗體。

本方案篩選的兔單抗較傳統方法雜(zá)交瘤技術篩選的抗體及兔多抗的親和(hé)力和(hé)特異性更高(gāo)，具有靈敏度高(gāo)、穩定性強的特點，檢測範圍爲0.78-50ng/mL，爲開(kāi)發高(gāo)靈敏度的BSA殘留檢測試劑盒奠定了(le)堅實的基礎。

圖1 普健生物Xten^TMMab兔單克隆抗體開(kāi)發流程

動物免疫及單B細胞分選

利用(yòng)普健生物開(kāi)發的快(kuài)速免疫方法免疫新西蘭大(dà)白(bái)兔，三免（Day21）血清效價大(dà)于128K，可以進行後續單B細胞流式分選。然後将從(cóng)PBMC中分離篩選到(dào)的B細胞進行抗原特異性檢測，陽性率大(dà)于60%。

抗原	BSA
包被	1ug/ml*100ul

	2k	4k	8k	16k	32k	64k	128k	PBS	效價
三免血清效價	4.32	3.32	3.26	2.98	2.53	1.85	1.16	0.03	>128K

圖2 BSA兔血清三免（Day21）效價檢測結果

圖3 單B細胞ELISA檢測部分結果展示

陽性抗體測序及序列分析

根據單B細胞ELISA檢測結果，挑選12個克隆進行抗體基因測序及分析，12個克隆測序全部成功。

圖4 抗體可變區(qū)基因分析結果

重組兔抗表達及鑒定

将測序得到(dào)的12個抗體挑選10個，利用(yòng)普健生物自(zì)主開(kāi)發的XtenCHO系統進行重組表達，純化後得到(dào)純度高(gāo)，親和(hé)力好(hǎo)的重組兔單抗。10株重組兔單抗ELISA效價均大(dà)于1:1000000。

圖5 重組兔抗SDS-PAGE檢測結果

圖6 純化後重組兔抗ELISA檢測結果

BSA抗體對(duì)開(kāi)發

将10株重組兔單抗進行方陣實驗配對(duì)，得到(dào)多對(duì)靈敏度高(gāo)的抗體對(duì)，優選其中一對(duì), 标曲線性範圍0.78-50ng/mL, R²=0.9992。

圖7 BSA抗體對(duì)标準曲線

抗BSA鼠單抗和(hé)兔單抗親和(hé)力比較

爲了(le)了(le)解不同方法制備抗體親和(hé)力的差異，我們将BSA的兔單抗與之前自(zì)産的用(yòng)傳統雜(zá)交瘤制備的BSA鼠單抗進行了(le)親和(hé)力的測試。在此，我們利用(yòng)OPENSPR将鼠單抗、兔單抗和(hé)BSA進行了(le)親和(hé)力檢測，發現(xiàn)兔單抗的親和(hé)力比鼠單抗高(gāo)1-2個數量級。

	ka(1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
BSA&兔抗3D5	2.21E+05	1.90E-05	8.61E-11
BSA&兔抗6B7	1.39E+05	7.49E-06	5.38E-11
BSA&鼠抗1	2.81E+04	1.39E-04	4.95E-09
BSA&鼠抗2	1.48E+05	2.02E-05	1.36E-10

剩餘未分選的B細胞以及篩選陽性的其他(tā)單B細胞可以凍存，以便用(yòng)于後續篩選其他(tā)應用(yòng)需求的抗體。

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普健生物（AtaGenix）于2012年在武漢成立，作(zuò)爲武漢國家生物産業基地公共服務平台—光谷抗體發現(xiàn)與篩選公共服務平台。普健生物（AtaGenix）專注于重組蛋白(bái)、抗體、診斷原料、抗體藥物發現(xiàn)等自(zì)主技術平台的建設和(hé)下(xià)遊生物醫(yī)藥産品的戰略合作(zuò)。經過10年的發展，普健生物已成爲一家立足武漢，業務覆蓋全國、輻射全球的高(gāo)新技術服務企業。目前公司擁有4200平米自(zì)建實驗室（包含800平高(gāo)标準BSL-2級細胞房），擁有齊全蛋白(bái)抗體開(kāi)發設備500餘套，包括高(gāo)通量蛋白(bái)純化儀、Agilent 流式細胞分析儀，全自(zì)動HPLC分析儀，openSPR蛋白(bái)、抗體親和(hé)力測定儀，Olympus熒光顯微鏡，BTX電融合儀，2*7L微生物發酵罐，中試型高(gāo)壓均質機，全自(zì)動管式化學發光儀，以及配套的高(gāo)速離心機，細胞計(jì)數儀及大(dà)容量細胞培養搖床。公司先後獲得榮譽：3551人才計(jì)劃、高(gāo)新技術企業、技術先進型服務企業、光谷瞪羚企業

普健生物依托自(zì)主研發的高(gāo)通量活性蛋白(bái)表達系統，Single B細胞抗體發現(xiàn)技術平台，噬菌體展示抗體庫技術和(hé)雜(zá)交瘤抗體開(kāi)發平台，抗體表達、抗體人源化和(hé)穩定細胞株構建平台，與各研究機構展開(kāi)技術服務項目合作(zuò)，助力IVD檢測、疫苗生産、重組抗體開(kāi)發。

普健生物一站(zhàn)式抗體發現(xiàn)平台，專注于活性蛋白(bái)，功能(néng)性抗體開(kāi)發。

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