重組膠原蛋白(bái)表達體系研究進展

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膠原蛋白(bái)是哺乳動物中含量最多的蛋白(bái)質，至今已發現(xiàn)28種類型，主要分爲纖維性膠原蛋白(bái)、網狀膠原蛋白(bái)、珠狀絲狀膠原蛋白(bái)、錨定纖維蛋白(bái)、膜蛋白(bái)以及multiplexins膠原蛋白(bái)，其中纖維性膠原蛋白(bái)中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型膠原蛋白(bái)占人體膠原蛋白(bái)的80%~90%。

膠原蛋白(bái)是人體細胞外(wài)基質的主要蛋白(bái)質，在人體中含量豐富，占人體蛋白(bái)質三分之一，占皮膚幹重四分之三，對(duì)于骨骼、皮膚、關節起關鍵的連接作(zuò)用(yòng)。除了(le)結構上(shàng)的作(zuò)用(yòng)外(wài)，膠原蛋白(bái)還可以與各種大(dà)分子如整合素、裝飾蛋白(bái)、纖維連接蛋白(bái)、肝素和(hé)基質金(jīn)屬蛋白(bái)酶（MMP）發生相互作(zuò)用(yòng)，在調節組織再生過程中十分重要。

作(zuò)爲哺乳動物含量最豐富的蛋白(bái)質，膠原蛋白(bái)爲哺乳動物組織提供主要的結構與機械支持，是一種結構特殊、功能(néng)多樣的蛋白(bái)質，基于其開(kāi)發的産品已經廣泛應用(yòng)于生物醫(yī)藥、化妝品、皮革、生物科技等行業。膠原蛋白(bái)作(zuò)爲一種生物聚合物，還可以與其他(tā)親水(shuǐ)性聚合物混合形成高(gāo)質量水(shuǐ)凝膠和(hé)可生物降解的支架，其中膠原蛋白(bái)與殼聚糖共混物的制備已經成爲科學界重點關注的課題。目前，根據來(lái)源，膠原蛋白(bái)大(dà)緻分爲動物源膠原蛋白(bái)和(hé)重組膠原蛋白(bái)。動物源膠原蛋白(bái)主要來(lái)源于陸生動物以及海洋動物，而重組膠原蛋白(bái)是指将人膠原蛋白(bái)基因克隆到(dào)選定的表達載體并轉化到(dào)表達細胞内，最後通過純化技術所獲得的蛋白(bái)質。

膠原蛋白(bái)是含有三螺旋結構的纖維狀膠原蛋白(bái)，約占蛋白(bái)總質量的三分之一，其中哺乳動物中膠原蛋白(bái)含量最高(gāo)的是肌腱（80%），其次是皮膚（70%）、骨骼（25%）以及主動脈（20%）。膠原蛋白(bái)的基本組成單位是由3條α鏈組成的原膠原。正是由于原膠原分子中3個平行α鏈以一個接一個殘基交錯形成的聚脯氨酸Ⅱ型（PPⅡ）左手螺旋構象決定了(le)膠原蛋白(bái)結構。擁有正确折疊的三螺旋結構對(duì)于膠原蛋白(bái)在細胞外(wài)基質實現(xiàn)細胞與細胞之間相互作(zuò)用(yòng)至關重要。在三螺旋結構中每一個α鏈都由重複肽三聯體（Gly-Xaa-Yaa）組成，其中Xaa和(hé)Yaa通常是脯氨酸和(hé)羟脯氨酸。由于高(gāo)度螺旋化，三聯體中的3個氨基酸殘基在螺旋内部占據不同的位置。其中，甘氨酸殘基埋藏在中心，溶劑不容易進入；Xaa位置的氨基酸殘基高(gāo)度暴露于溶劑中；Yaa位置由于靠近相鄰鏈，因此被溶劑接觸的可能(néng)性較低(dī)。對(duì)Gly-Xaa-Yaa的大(dà)量研究揭示了(le)影響膠原蛋白(bái)三螺旋結構穩定的多重因素，這(zhè)些(xiē)因素包括3條鏈條的緊密包裝、鏈之間形成的氫鍵、廣泛的水(shuǐ)合網絡以及高(gāo)含量的脯氨酸和(hé)羟脯氨酸形成。

膠原蛋白(bái)作(zuò)爲最豐富的動物蛋白(bái)，至今已發現(xiàn)28種類型，而根據膠原蛋白(bái)所形成具有不同活性的形态結構可将膠原蛋白(bái)類型大(dà)緻分爲纖維性膠原蛋白(bái)與非纖維性膠原蛋白(bái)。纖維性膠原蛋白(bái)中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型膠原蛋白(bái)占人體膠原蛋白(bái)的80%～90%。Ⅰ型膠原蛋白(bái)作(zuò)爲人體中最常見的膠原蛋白(bái)，主要分布在皮膚、肌腱和(hé)骨骼中，Ⅱ型主要分布在軟骨中，Ⅲ型主要分布在皮膚和(hé)血管系統中。
膠原蛋白(bái)類型、分布及功能(néng)

膠原蛋白(bái)的形成始于膠原蛋白(bái)編碼基因通過轉錄、翻譯等作(zuò)用(yòng)形成新生膠原蛋白(bái)α鏈（稱爲前α鏈），膠原蛋白(bái)前α鏈在内質網中先後經曆脯氨酸-4-羟化酶（P4H）與賴氨酸羟化酶（LH）的修飾作(zuò)用(yòng)，使Gly-Xaa-Yaa中Yaa位上(shàng)的脯氨酸殘基與賴氨酸殘基分别羟基化，而一部分羟基化賴氨酸殘基則進一步糖基化。脯氨酸羟基化和(hé)賴氨酸羟基化分别是實現(xiàn)三螺旋結構的穩定性和(hé)細胞外(wài)成熟膠原交聯的必需步驟。若新生膠原蛋白(bái)α鏈羟基化出現(xiàn)畸形，形成的不良膠原蛋白(bái)三螺旋結構将在細胞内堆積，導緻蛋白(bái)質折疊和(hé)内質網應激反應。除了(le)P4H與LH作(zuò)用(yòng)外(wài)，前膠原蛋白(bái)α鏈還需要脯氨酸-3-羟化酶（P3H）進行修飾。随後，3條膠原蛋白(bái)前α鏈的C端前肽在内質網膜凝集素樣分子伴侶、鈣聯蛋白(bái)和(hé)内質網氧化還原酶PDI的協同作(zuò)用(yòng)下(xià)形成的二硫鍵，并将膠原蛋白(bái)α單鏈三聚體化，形成三螺旋構象，這(zhè)種構象從(cóng)C端一直持續到(dào)N端。同時(shí)，膠原蛋白(bái)特異性分子伴侶HSP47與三螺旋前膠原蛋白(bái)相互作(zuò)用(yòng)，防止前膠原蛋白(bái)局部展開(kāi)和(hé)聚集。經膠原蛋白(bái)特異性分子伴侶HSP47作(zuò)用(yòng)後，前膠原蛋白(bái)被内質網出口TANGO1識别，運輸到(dào)高(gāo)爾基體中。在高(gāo)爾基體中，HSP47從(cóng)前膠原蛋白(bái)解離，并通過KDEL（REDL）受體返回内質網中。同時(shí)，高(gāo)爾基體将前膠原蛋白(bái)運送分泌到(dào)細胞外(wài)基質，通過N端酶與C端酶的共同作(zuò)用(yòng)将前膠原蛋白(bái)多餘N端與C端前肽進行切除，形成完整的膠原蛋白(bái)分子。

膠原蛋白(bái)合成機制圖

重組膠原蛋白(bái)的表達體系主要包括原核生物（主要爲大(dà)腸杆菌）、酵母、植物、杆狀病毒、哺乳動物細胞表達體系。現(xiàn)階段表達體系中以大(dà)腸杆菌、酵母爲主，但(dàn)高(gāo)效的大(dà)腸杆菌、酵母等表達體系缺乏動物細胞中膠原蛋白(bái)翻譯後修飾，需要添加相對(duì)應的重組酶。而植物、杆狀病毒、哺乳動物細胞表達體系所産生膠原蛋白(bái)含量雖然遠低(dī)于大(dà)腸杆菌、酵母體系，但(dàn)具有完整的三螺旋結構和(hé)較好(hǎo)的熱穩定性。不同重組膠原蛋白(bái)表達體系表達膠原蛋白(bái)所需成本仍有比較大(dà)的區(qū)别，植物表達體系因其具備光合作(zuò)用(yòng)自(zì)生産能(néng)力，其表達膠原蛋白(bái)成本相對(duì)較低(dī)；大(dà)腸杆菌以及酵母雖然具備一定發酵成本，但(dàn)由于其表達産量較高(gāo)，表達單位膠原蛋白(bái)所需成本也(yě)較低(dī)，但(dàn)表達的膠原蛋白(bái)缺乏羟基化及相應活性；昆蟲杆狀病毒表達體系由于其表達量少，生産周期長，因此其表達單位膠原蛋白(bái)成本較高(gāo)；哺乳動物細胞表達體系屬于高(gāo)級重組表達體系，由于其表達體系複雜(zá)，培養要求高(gāo)，因此其表達單位膠原蛋白(bái)的成本也(yě)較高(gāo)。

重組膠原蛋白(bái)相較于傳統動物提取膠原蛋白(bái)，具有更高(gāo)親水(shuǐ)性、更高(gāo)生物活性區(qū)域、更優異的抗氧化性能(néng)以及止血與促傷口愈合能(néng)力。重組膠原蛋白(bái)自(zì)研發以來(lái)，在生物醫(yī)藥工(gōng)程中得到(dào)廣泛的應用(yòng)。
在皮膚修複上(shàng)，Zhao等發明(míng)的MTGase交聯重組類人膠原蛋白(bái)水(shuǐ)凝膠具有良好(hǎo)的生物相容性，在動物實驗中也(yě)證實該材料具備較低(dī)的毒性，有望作(zuò)爲水(shuǐ)凝膠材料修複皮膚損傷。Pan等通過反複凍融聚乙烯醇、重組人類膠原蛋白(bái)與羧甲基殼聚糖的混合液得到(dào)水(shuǐ)凝膠敷料，該敷料與商業敷料相比，能(néng)顯著促進全層皮膚傷口愈合，顯示了(le)其作(zuò)爲皮膚創面愈合創面敷料的巨大(dà)潛力。Woodly等通過獲得重組人Ⅶ型膠原蛋白(bái)，将其遷移到(dào)隐性營養不良大(dà)疱性表皮松解症患者的真皮-表皮交界處，有效預防皮膚起泡與糜爛的形成；Dong等在近年來(lái)證實将重組類人膠原蛋白(bái)與重組類人纖連蛋白(bái)聯合治療C57BL/6小(xiǎo)鼠的急性傷口的效果高(gāo)于兩者單獨治療效果，爲重組膠原在皮膚治療修複方面開(kāi)辟了(le)嶄新道(dào)路。McLaughlin等通過将重組人Ⅰ型膠原蛋白(bái)與重組人Ⅲ型膠原蛋白(bái)制成可注射生物材料，将二者注入到(dào)心肌梗死增殖後期的小(xiǎo)鼠身上(shàng)，發現(xiàn)使用(yòng)重組人Ⅰ型膠原蛋作(zuò)爲注射材料可以有效促進愈合環境、心肌細胞存活以及減少心肌病理(lǐ)性重塑，有利于實現(xiàn)心肌梗死後重塑。

在眼科疾病上(shàng)，Fagerholm等利用(yòng)重組膠原蛋白(bái)植入10名圓錐角膜或角膜瘢痕患者，結果發現(xiàn)，所有患者淚膜得到(dào)恢複，基質細胞被招募到(dào)植入物中。還觀察到(dào)患者神經再生和(hé)觸摸敏感性恢複，與人類供體組織相比，兩者都達到(dào)更高(gāo)的程度。通過進一步優化，生物合成角膜植入物可以提供一種安全有效的替代人體組織植入的方法，幫助解決目前供體角膜短缺的問題。随後兩年，Fagerholm團隊開(kāi)發了(le)一種由碳二亞胺交聯重組人膠原蛋白(bái)組成的無細胞植入物，通過植入眼角膜細胞實現(xiàn)了(le)角膜再生，在4年多的時(shí)間裏，再生的新角膜穩定整合在一起，無排斥反應，也(yě)沒有發生供體角膜患者所需的長期免疫抑制機制。實驗證明(míng)，由碳二亞胺交聯重組人膠原蛋白(bái)組成的無細胞植入物可以實現(xiàn)角膜的再生。因此，重組人膠原蛋白(bái)可作(zuò)爲良好(hǎo)的角膜修複植入物。

目前，重組膠原蛋白(bái)由于具有較好(hǎo)的生物相容性、更高(gāo)的安全性以及對(duì)皮膚保濕修複明(míng)顯的特點，在膠原蛋白(bái)家族中占有重要地位。随着分子生物學、蛋白(bái)質工(gōng)程等的學科發展，重組膠原蛋白(bái)的研究将進一步深入，最終爲生物醫(yī)藥領域提供更優質、更安全、更廉價的重組膠原蛋白(bái)原料。

參考文(wén)獻：
PAN Jiahao, PAN Weisong, QIU Jian, XIE Donling, ZOU Qi, WU Chuan. Research progress on recombinant collagen expression system. Synthetic Biology Journal[J], 2023, 4(4): 808-823 doi:10.12211/2096-8280.2023-020

 

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