用(yòng)于疾病的人源化抗體制備技術的發展

單克隆抗體（monoclonalantibody，mAb）B細胞産生的、由兩條相同的輕鏈和(hé)兩條相同的重鏈組成的Y形結構蛋白(bái)。其中抗原結合片段（antigenbindingfragments，Fab）由一條重鏈和(hé)一條輕鏈的6個互補決定區(qū)（complementarity-determiningregion，CDR）組成。Fab段決定了(le)抗體結合抗原的特異性和(hé)親和(hé)力；單抗的恒定區(qū)（Fc）通過結合細胞表面Fc受體來(lái)發揮抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作(zuò)用(yòng)（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC）、補體依賴的細胞毒性作(zuò)用(yòng)（complementdependentcytotoxicity，CDC）等功能(néng)。

目前，治療性單抗已廣泛應用(yòng)于癌症、自(zì)身免疫性疾病、傳染病等多種疾病，爲許多患者帶來(lái)了(le)全新的希望。但(dàn)由于人抗鼠（humanantimouseantibody，HAMA）反應的存在，抑制了(le)鼠單抗的臨床應用(yòng)，因此湧現(xiàn)了(le)一系列抗體工(gōng)程技術，如抗體人源化、噬菌體展示、轉基因小(xiǎo)鼠、單細胞PCR等技術，可以實現(xiàn)鼠單抗人源化改造以及親和(hé)力提高(gāo)，或者直接篩選制備人源化/全人抗體，加速了(le)單抗的臨床轉化和(hé)應用(yòng)。

抗體人源化
全人源、人源化和(hé)鼠源抗體分别占臨床應用(yòng)單抗的51%、46%和(hé)3%，可見人源化和(hé)全人源單抗已經成爲治療性抗體研發的主流。人源化抗體具有免疫原性低(dī)，體内半衰期長，有效誘導ADCC、CDC效應等優點。早期的人源化技術是将鼠單抗的可變區(qū)與人抗恒定區(qū)相連從(cóng)而獲得嵌合抗體。選擇性阻斷血小(xiǎo)闆糖蛋白(bái)Ⅱb/Ⅲa受體的阿昔單抗（Abciximab）于1994年被美(měi)國FDA批準用(yòng)于抑制血小(xiǎo)闆聚集，成爲第一個嵌合抗體藥物，抗CD20嵌合抗體利妥昔單抗于1997年被美(měi)國FDA批準用(yòng)于非霍奇金(jīn)淋巴瘤，成爲首個用(yòng)于腫瘤的嵌合抗體。
爲了(le)提高(gāo)抗體人源化程度，CDR移植技術應運而生，将除了(le)CDR區(qū)以外(wài)的序列替換爲人源（如果鼠抗FR框架中的某些(xiē)氨基酸對(duì)維持抗原的識别至關重要，那麽這(zhè)些(xiē)殘基也(yě)需要保留），進一步降低(dī)免疫原性。如FDA于1997年批準的首個用(yòng)于預防移植排斥反應的人源化單抗——抗IL-2受體抗體達利珠單抗（Daclizumab），而最著名的人源化抗體當屬1998年獲批的抗HER2單抗曲妥珠單抗（Herceptin），從(cóng)誕生以來(lái)連續登上(shàng)十大(dà)藥物暢銷榜。
目前，普健生物提供完善的抗體人源化服務，僅需提供原始抗體序列，普健可幫助客戶通過成熟的方法分析抗原-抗體複合物的結構，了(le)解直接作(zuò)用(yòng)的關鍵殘基，完成人源化抗體設計(jì)，通過一站(zhàn)式抗體平台完成基因合成及克隆、瞬轉表達純化等服務，并形成實驗報(bào)告。
服務優勢
1、普健生物擁有經驗豐富的抗體人源化團隊，團隊的技術專家曾經成功研制上(shàng)市的治療性抗體藥物
2、普健生物擁有自(zì)主開(kāi)發的高(gāo)表達載體及細胞系，以及具有商業開(kāi)發license的細胞系
3、普健生物具有一站(zhàn)式從(cóng)細胞系開(kāi)發，到(dào)發酵培養條件優化，再到(dào)150L細胞罐發酵，完成整個治療性抗體的研發能(néng)力


噬菌體展示技術
噬菌體展示技術是基于噬菌體表面蛋白(bái)（如PⅢ蛋白(bái)）的結構及包裝特點，将外(wài)源抗體基因和(hé)外(wài)殼蛋白(bái)融合表達并展示在鞭毛表面，實現(xiàn)靶抗原特異性抗體的快(kuài)速篩選。1985年，GeorgeP.Smith使用(yòng)重組DNA技術，将外(wài)源肽與噬菌體M13的外(wài)殼蛋白(bái)PⅢ融合，在噬菌體表面展示肽。此後他(tā)創建了(le)“抗體選擇性噬菌體載體”，能(néng)夠從(cóng)1×10⁸庫容噬菌體池中篩選特異性抗體。噬菌體展示抗體的形式可以是單鏈抗體（singlechainantibodyfragment，scFv）或Fab片段，scFv由VH和(hé)VL組成，二者之間由一個短而靈活的連接肽相連，而Fab具有相對(duì)較高(gāo)的穩定性，其結合能(néng)力與完整的IgG抗體相當。
由于噬菌體顆粒小(xiǎo)、容易擴增和(hé)富集，溶解度高(gāo)（1×10¹³pfu/mL），因此可以實現(xiàn)抗體的大(dà)容量展示。噬菌體展示文(wén)庫的基因庫可以從(cóng)原始或免疫人類或動物中獲得，也(yě)可以使用(yòng)随機CDR合成法構建文(wén)庫，隻要庫容足夠大(dà)，都可以産生針對(duì)多種抗原靶點的高(gāo)親和(hé)力抗體（親和(hé)力達納摩爾級）。普健生物基于豐富的噬菌體抗體技術經驗以及上(shàng)百個噬菌體展示抗體項目成功開(kāi)發經驗，具有全人源重組抗體庫，庫容高(gāo)達千億級别(10¹¹pfu），支持兩步建庫法，保證了(le)文(wén)庫的多樣性，抗體庫片段插入正确率高(gāo)，可以兩周拿到(dào)全人源重組抗體，并支持構建多種物種(人源、小(xiǎo)鼠、兔子、羊駝等)、多種類型(scfv、Fab、VHH等)的抗體文(wén)庫。


FDA已經批準了(le)多種從(cóng)噬菌體展示文(wén)庫中獲得的全人源抗體。如2002年獲批上(shàng)市的阿達木(mù)單抗（Adalimumab），迄今仍是世界上(shàng)最暢銷的藥物。

轉基因動物
轉基因動物是全人源抗體的又一重要來(lái)源，通過對(duì)細胞系進行基因改造，将人類免疫球蛋白(bái)（Ig）基因取代動物内源性Ig基因，使這(zhè)些(xiē)動物在免疫後能(néng)夠合成人類抗體。首個轉基因小(xiǎo)鼠來(lái)源的全人抗體帕尼單抗（Panitumab）是抗EGFR抗體，于2006年獲得美(měi)國FDA批準。同樣來(lái)源于轉因因動物技術的還有2種用(yòng)于自(zì)身免疫性皮膚病的人抗：IL-17α抗體司庫奇尤單抗（Secukinumab）以及IL-17R抗體柏達魯單抗（Brodalumab），分别于2015年和(hé)2017年獲得美(měi)國FDA批準用(yòng)于銀屑病。

單B細胞抗體技術
使用(yòng)傳統的雜(zá)交瘤技術、抗體庫或轉基因小(xiǎo)鼠技術生産治療性人類抗體往往需要長期的免疫程序和(hé)多輪篩選，而單細胞抗體技術可以從(cóng)外(wài)周血中直接進行陽性細胞分選和(hé)抗體基因克隆，直接進入哺乳動物細胞表達步驟，因此在突發傳染病等緊急情況下(xià)，單B細胞抗體技術的優勢尤爲明(míng)顯。普健生物新型的Xten™MabSingleB兔單克隆抗體開(kāi)發技術平台，利用(yòng)B細胞分選富集策略，在流式分選設備的支持下(xià)，有效富集抗原特異性B細胞，提高(gāo)B細胞體外(wài)培養的成活率，保留B細胞的多樣性，可開(kāi)發出不同應用(yòng)需求的抗體。
案例展示：

總體而言，治療性抗體領域發展迅速，擁有巨大(dà)的發展潛力。基于已有的單抗研發技術，結合下(xià)一代測序技術、高(gāo)通量篩選、抗體恒定區(qū)改造技術，借鑒新型支架蛋白(bái)、修飾抗體以
及抗體分子設計(jì)等經驗，可以最大(dà)限度地提高(gāo)抗體藥物的療效和(hé)安全性，展現(xiàn)最優藥效、藥代及藥理(lǐ)特性。

參考文(wén)獻
[1]FENGJiannan,QIAOChunxia.Progression on research technology of human therapeutic antibody.[J].Journal of Nanjing Medical University(Natural Sciences),2020,40(11):1571-1574.