重組蛋白(bái)質在大(dà)腸杆菌體系中的可溶性表達策略

大(dà)腸杆菌表達體系因其表達量高(gāo)、周期短、成本低(dī)等諸多優勢特征而被廣泛用(yòng)作(zuò)重組異源蛋白(bái)質的表達宿主。據統計(jì)超過30%的重組蛋白(bái)質藥物和(hé)50%重組蛋白(bái)質的制備是使用(yòng)大(dà)腸杆菌作(zuò)爲表達宿主。蛋白(bái)質錯誤折疊或未折疊以及包涵體形成是大(dà)腸杆菌表達體系更廣泛應用(yòng)的主要阻礙。因此，重組蛋白(bái)質在大(dà)腸杆菌體系中可溶性表達策略探索意義重大(dà)。

盡管大(dà)腸杆菌表達體系有許多優點，但(dàn)是在實際應用(yòng)中也(yě)仍然存在一些(xiē)不足之處，主要包括：(1)缺乏翻譯後修飾。相較于真核表達體系，原核表達系統最大(dà)的局限性之一在于其缺乏類似于真核生物翻譯後修飾的能(néng)力，如糖基化修飾、二硫鍵氧化形成等。這(zhè)些(xiē)修飾與重組蛋白(bái)質的可溶性、穩定性及生物活性密切有關。(2)無輔助蛋白(bái)質折疊機制。原核表達體系缺乏輔助蛋白(bái)質折疊機制，重組蛋白(bái)質在原核表達體系表達過程中通常以一種自(zì)發折疊的方式形成特定結構，對(duì)于部分結構複雜(zá)、疏水(shuǐ)性強的蛋白(bái)質易于導緻錯誤折疊，最終形成無活性的包涵體(IBs)。據估計(jì)，大(dà)約隻有30%異源蛋白(bái)質可以在大(dà)腸杆菌中以可溶性形式表達，其餘以包涵體的不溶性聚集物表達，或在細胞提取物中無法檢測到(dào)，是蛋白(bái)質生産和(hé)純化過程中不可忽視(shì)的瓶頸，所以通過優化表達策略，改善異源蛋白(bái)質在原核表達體系中的可溶性表達也(yě)是目前研究的焦點。

那麽，重組蛋白(bái)質在大(dà)腸杆菌中通過哪些(xiē)途徑形成包涵體的呢(ne)？
自(zì)身氨基酸組成：重組蛋白(bái)質氨基酸組成中含硫氨基酸及脯氨酸的數量和(hé)比例能(néng)夠顯著影響重組蛋白(bái)質在大(dà)腸杆菌中的表達形式，含量越高(gāo)，重組蛋白(bái)質更容易形成包涵體。
親疏水(shuǐ)性強弱：從(cóng)本質上(shàng)講，蛋白(bái)質的折疊過程在一定程度上(shàng)是由疏水(shuǐ)相互作(zuò)用(yòng)驅動的，同時(shí)蛋白(bái)質的聚集過程極大(dà)程度是分子間疏水(shuǐ)作(zuò)用(yòng)的結果。蛋白(bái)質自(zì)身疏水(shuǐ)性越強，分子間更容易因疏水(shuǐ)作(zuò)用(yòng)引發聚集，使蛋白(bái)質錯誤折疊的概率越大(dà)。
蛋白(bái)質合成速度：與真核表達系統不同，大(dà)腸杆菌的轉錄和(hé)翻譯是快(kuài)速且緊密耦合的，而快(kuài)速的蛋白(bái)質合成速度對(duì)具有複雜(zá)結構蛋白(bái)質的折疊卻是緻命的。由于許多真核生物蛋白(bái)質需要更長時(shí)間和(hé)/或折疊伴侶的幫助才能(néng)折疊成它們的天然狀态，蛋白(bái)質合成速率提高(gāo)一方面通常會(huì)導緻沒有足夠時(shí)間進行正确的結構折疊，另一方面蛋白(bái)質過快(kuài)合成使重組蛋白(bái)質折疊前體快(kuài)速積累緻使缺乏足夠的折疊空(kōng)間極大(dà)程度上(shàng)增加了(le)重組蛋白(bái)質之間的相互作(zuò)用(yòng)，形成蛋白(bái)質聚核，促使并加速更多蛋白(bái)質聚集，聚集部分折疊、未折疊或錯誤折疊的不溶性蛋白(bái)質。
重組蛋白(bái)質分子大(dà)小(xiǎo)及結構複雜(zá)程度：大(dà)腸杆菌的平均蛋白(bái)質長度爲317個殘基，而人類的平均蛋白(bái)質長度爲510個殘基。重組蛋白(bái)質分子越大(dà)，結構往往越複雜(zá)，其所涉及的結構域通常越多，在蛋白(bái)質折疊過程中需要克服的分子勢能(néng)壁壘就越多，其折疊成爲準确結構的概率就越低(dī)。因此分子結構更複雜(zá)、尺寸更大(dà)的蛋白(bái)質在大(dà)腸杆菌系中的表達常伴随着因未能(néng)及時(shí)正确折疊或本身疏水(shuǐ)性結構異常暴露而聚集形成包涵體的風(fēng)險就會(huì)越高(gāo)。

結構折疊難易程度：重組蛋白(bái)質中高(gāo)級結構類型，特别是二級結構的組成比例能(néng)夠顯著影響蛋白(bái)質的折疊速度。有研究表明(míng)α螺旋結構的折疊速度相比于β發夾結構的折疊速度快(kuài)近30倍。
二硫鍵形成與否及數量：蛋白(bái)質中的二硫鍵由兩個半胱氨酸殘基的硫原子共價連接形成，對(duì)蛋白(bái)質正确折疊、結構剛性、熱力學穩定性和(hé)生物活性至關重要。在大(dà)腸杆菌中表達含有二硫鍵的重組蛋白(bái)質，往往容易因爲其天然剛性結構難以形成而導緻重組蛋白(bái)質間互相交聯在一起，形成不溶性的無活性聚集體，這(zhè)種情況即使重組蛋白(bái)質分泌至周質中，通常也(yě)難以氧化形成正确的空(kōng)間結構，需要借助二硫鍵氧化酶或分子伴侶才能(néng)得以完成。

可溶性和(hé)功能(néng)性蛋白(bái)質的制備獲取是生物工(gōng)業應用(yòng)的主要目标之一，自(zì)然途徑難以獲得令人滿意的産量，通過原核表達體系制備高(gāo)效、低(dī)成本的功能(néng)性重組蛋白(bái)質成爲越來(lái)越廣泛的選擇。影響重組蛋白(bái)質在大(dà)腸杆菌體系中表達形式及表達水(shuǐ)平的因素很(hěn)多，可分爲主觀性因素和(hé)客觀性因素。主觀性因素包括蛋白(bái)質自(zì)身結構、氨基酸組成、親疏水(shuǐ)性及二硫鍵數量等，客觀性因素包括表達場所、分子伴侶(融合/非融合)、宿主類型、誘導策略、載體類型等。改善或提高(gāo)重組蛋白(bái)質在大(dà)腸杆菌體系中可溶性表達的策略主要針對(duì)以上(shàng)主客觀因素進行優化。

密碼子偏好(hǎo)性優化：參與蛋白(bái)質翻譯過程中氨基酸識别與轉運的密碼子組成具有簡并性和(hé)物種偏好(hǎo)性。密碼子偏好(hǎo)性對(duì)重組蛋白(bái)質在大(dà)腸杆菌表達體系中的表達有着直接影響，蛋白(bái)質的正确折疊依賴于基因的順暢表達，如含有大(dà)量單個或少量串列稀有密碼子（包括AGA、AGG、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA和(hé)GTC等）的目的基因在大(dà)腸杆菌中更容易出現(xiàn)翻譯限速，甚至停滞的現(xiàn)象，導緻蛋白(bái)質折疊錯誤。因此，重組蛋白(bái)質目的基因密碼子的偏好(hǎo)性優化對(duì)提高(gāo)重組蛋白(bái)質在大(dà)腸杆菌表達體系中的高(gāo)水(shuǐ)平表達具有重要意義。
重組蛋白(bái)質誘導表達溫度優化：溫度對(duì)大(dà)腸杆菌生長、質粒穩定性、重組蛋白(bái)質表達速度及蛋白(bái)質折疊效率等有顯著影響。大(dà)腸杆菌的最佳培養溫度一般爲37℃，此溫度可能(néng)并不總是有利于目的基因在大(dà)腸杆菌中表達。在較低(dī)溫度下(xià)，細菌生命代謝(xiè)速度減慢，降低(dī)轉錄、翻譯速度，較慢的翻譯速率有利于蛋白(bái)質正确折疊，同時(shí)溫度降低(dī)時(shí)聚集作(zuò)用(yòng)也(yě)得以減弱，有利于蛋白(bái)質折疊和(hé)提高(gāo)重組蛋白(bái)質可溶性表達比例。
表達載體選擇與優化：表達載體通常包括複制子、篩選标記基因、啓動子及轉錄終止子等元件，大(dà)腸杆菌的常用(yòng)表達載體包括pET系列、pCold系列、pBV系列和(hé)pGEX系列等。不同載體之間包含的元件類型和(hé)數量具有明(míng)顯差異。載體的啓動子類型對(duì)目的基因表達水(shuǐ)平和(hé)表達方式(可溶或不可溶)的影響非常顯著。常見大(dà)腸杆菌表達體系的啓動子類型包括來(lái)源于細菌的lac、tac、trp、araBAD啓動子，以及來(lái)源于噬菌體的T7、T5、SP6啓動子。pET表達載體因其具有T7強啓動子而獲得較高(gāo)表達量，是最常使用(yòng)的啓動子類型。
誘導策略及優化：異丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)是原核表達體系最常用(yòng)的重組蛋白(bái)質表達誘導劑之一。通過調節IPTG濃度來(lái)調控重組蛋白(bái)質的表達速度，促進蛋白(bái)質可溶性表達，建議(yì)在10μmol/L以下(xià)濃度範圍内優化；在大(dà)腸杆菌乳糖操縱子表達系統中，無須額外(wài)加入IPTG誘導劑的自(zì)動誘導表達策略也(yě)是常見的更加溫和(hé)的誘導方式；熱誘導不用(yòng)添加外(wài)來(lái)誘導物，成本低(dī)，但(dàn)是發酵過程中加熱升溫培養，細菌的生長和(hé)代謝(xiè)均加速，在一定程度上(shàng)加快(kuài)了(le)重組蛋白(bái)質的翻譯合成速度，增加蛋白(bái)質折疊負擔；因此可以嘗試在誘導時(shí)将培養溫度升高(gāo)至42℃後維持15~30 min，讓cIts857蛋白(bái)充分變構失活，解除阻遏，啓動轉錄，然後再将培養溫度降低(dī)至35℃以下(xià)，降低(dī)細菌的新陳代謝(xiè)和(hé)重組蛋白(bái)質表達速度，減輕蛋白(bái)質折疊負擔；低(dī)溫誘導能(néng)夠降低(dī)大(dà)腸杆菌的新陳代謝(xiè)，進而降低(dī)重組蛋白(bái)質合成速度，降低(dī)有聚集傾向的重組蛋白(bái)質折疊前體累積，一定程度上(shàng)減少包涵體形成的概率和(hé)提高(gāo)可溶性表達比例。
大(dà)腸杆菌表達宿主選擇：爲了(le)提高(gāo)蛋白(bái)質表達水(shuǐ)平，促進二硫鍵形成，提高(gāo)蛋白(bái)質正确折疊，改善蛋白(bái)質可溶性表達比例，各種類型的大(dà)腸杆菌宿主細胞被設計(jì)與改造。常見的大(dà)腸杆菌宿主包括E. coli BL21系列、Rosetta系列和(hé)Origami系列等。
表 大(dà)腸杆菌表達體系常用(yòng)宿主亞型類型 Commonly used commercial available E. coli host bacteria

胞内表達與分泌表達：通常情況下(xià)，大(dà)腸杆菌表達重組異源蛋白(bái)質采用(yòng)胞内形式表達，具有表達量高(gāo)的優勢，但(dàn)是大(dà)腸杆菌高(gāo)還原性及缺乏折疊伴侶分子的胞内環境導緻部分蛋白(bái)質在胞内表達時(shí)易形成包涵體。此種情況下(xià)，還可以考慮分泌表達。
細菌培養條件優化：大(dà)腸杆菌的培養環境也(yě)是影響外(wài)源蛋白(bái)質可溶性表達的關鍵因素之一，這(zhè)些(xiē)因素包括溫度、pH、微量元素等。溫度對(duì)細菌生長和(hé)重組蛋白(bái)質表達的影響是多方面的，包括細菌的生長速度、蛋白(bái)質合成速度、重組蛋白(bái)質折疊前體的聚集傾向程度、蛋白(bái)質穩定性和(hé)生物活性，以及重組蛋白(bái)質的溶解度等。綜合效益來(lái)看(kàn)，降低(dī)溫度往往更有利于重組蛋白(bái)質的可溶性表達。因此從(cóng)培養條件的角度，優化培養溫度對(duì)提高(gāo)蛋白(bái)質比例影響最大(dà)。pH也(yě)是影響蛋白(bái)質表達形成的因素之一，大(dà)腸杆菌生長的最适pH在6.5~7.5，與外(wài)源蛋白(bái)質等電點相差越大(dà)，所表達的蛋白(bái)質就更容易形成可溶性蛋白(bái)質。因此需要根據菌體和(hé)目的蛋白(bái)的特點選擇合适的pH，并保持培養基中pH 相對(duì)穩定。微量元素也(yě)能(néng)夠影響蛋白(bái)質的表達形式。研究表明(míng)向培養基中加入微量元素(Zn2+、Mg2+等)可以提高(gāo)目的蛋白(bái)的可溶性表達。這(zhè)可能(néng)是因爲異源蛋白(bái)質二硫鍵的形成是一個酶依賴性反應過程，向培養基中添加适量金(jīn)屬離子，能(néng)夠在一定程度上(shàng)提高(gāo)部分酶的活性，進而促進重組蛋白(bái)質折疊與穩定性。
促溶标簽融合表達：促溶标簽融合表達在增加重組蛋白(bái)質産率及提高(gāo)可溶性表達比例等方面具有重要應用(yòng)意義。常用(yòng)促溶标簽包括麥芽糖結合蛋白(bái)(MBP)、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、小(xiǎo)泛素樣修飾蛋白(bái)(SUMO)和(hé)硫氧還蛋白(bái)(Trx)等。
表 重組蛋白(bái)質表達常用(yòng)融合标簽類型Commonly used solubility-enhancing tags

分子伴侶共表達：通過分子伴侶協助重組蛋白(bái)質折疊提升重組蛋白(bái)質可溶性表達的方式主要爲将分子伴侶基因協同插入在表達載體上(shàng)，使其與目的基因共表達，應用(yòng)中常見的策略有單種分子伴侶過表達和(hé)多種伴侶系統協同過表達。
表 大(dà)腸杆菌表達體系常用(yòng)分子伴侶Commonly used chaperone family member in E. coli

大(dà)腸杆菌N-糖基化修飾：重組異源蛋白(bái)質在大(dà)腸杆菌中難以可溶性表達的主要因素之一在于缺乏翻譯後修飾功能(néng)，其中糖基化修飾對(duì)重組異源蛋白(bái)質的穩定性和(hé)溶解性具有極大(dà)影響。在一定程度上(shàng)，缺乏糖基化修飾是影響真核蛋白(bái)在大(dà)腸杆菌中可溶性表達的最主要因素。

蛋白(bái)質錯誤折疊或未折疊以及形成包涵體是大(dà)腸杆菌表達體系應用(yòng)的巨大(dà)阻礙。因此，探索可溶性表達策略對(duì)應用(yòng)大(dà)腸杆菌體系生産重組蛋白(bái)質意義重大(dà)。重組蛋白(bái)質自(zì)身的氨基酸組成、親疏水(shuǐ)性強弱、分子量大(dà)小(xiǎo)、結構複雜(zá)程度、結構折疊難易程度、二硫鍵形成與否、二硫鍵數量及重組蛋白(bái)質的合成速度等均能(néng)影響重組蛋白(bái)質在大(dà)腸杆菌表達體系中的表達形式和(hé)可溶性表達比例。因此，在大(dà)腸杆菌表達體系中實現(xiàn)更多重組異源蛋白(bái)質的可溶性與功能(néng)性表達仍然有諸多挑戰，未來(lái)還将從(cóng)以下(xià)幾個方面持續改進：其一，不斷完善重組異源蛋白(bái)質在胞内的結構折疊輔助體系，包括分子伴侶、融合伴侶等的設計(jì)與開(kāi)發;其二，進一步優化提高(gāo)在原核宿主系統中的二硫鍵氧化與正确形成能(néng)力；其三，持續改善大(dà)腸杆菌表達體系的糖基化能(néng)力和(hé)形式，包括糖基化效率和(hé)糖基化糖型優化等。


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