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非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是一種由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus, ASFV)感染引起的以廣泛性出血爲主要症狀的急性高(gāo)度接觸性烈性傳染病，發病率和(hé)死亡率高(gāo)，最急性和(hé)急性型感染的死亡率可高(gāo)達100%，目前尚無用(yòng)于防治ASF的商業疫苗或藥物。
p72蛋白(bái)是ASFV最外(wài)層蛋白(bái)質外(wài)殼的主要組成成分，約占病毒顆粒總質量的32%，在病毒感染晚期表達，參與ASFV結合和(hé)内化入侵宿主細胞、病毒膜運輸和(hé)遷移等過程。p72蛋白(bái)是檢測病毒時(shí)的主要抗原，由于其抗原性穩定，常被用(yòng)于血清學診斷。相對(duì)于抗體檢測，抗原檢測可更快(kuài)速地檢出ASFV，比較常用(yòng)的方法是雙抗體夾心Elisa法和(hé)膠體金(jīn)免疫層析技術。
以純化的原核表達的p72重組蛋白(bái)作(zuò)爲抗原免疫3隻Balb/c小(xiǎo)鼠，共免疫3次，每次免疫間隔14d。随後進行小(xiǎo)鼠血清抗體效價的檢測，當免疫小(xiǎo)鼠血清孔OD450值（P）/陰性小(xiǎo)鼠血清孔OD450值(N)≥2.1時(shí)，判定所檢測物質爲陽性。取小(xiǎo)鼠脾細胞進行細胞融合及陽性細胞株的篩選，，挑選出5株能(néng)穩定分泌單克隆抗體的雜(zá)交瘤細胞，并将其分泌的單克隆抗體分别進行蛋白(bái)免疫印迹（Western Blot，WB）鑒定、免疫熒光鑒定。随後，鑒定５ 株雜(zá)交瘤細胞的單克隆抗體亞型，選擇其中效價水(shuǐ)平較高(gāo)的３株單克隆抗體進行純化，對(duì)小(xiǎo)鼠腹腔注射能(néng)穩定分泌單克隆抗體的雜(zá)交瘤細胞，1×105個/隻，以辛酸－硫酸铵法純化腹水(shuǐ)中的單克隆抗體，采用(yòng)微量紫外(wài)分光光度計(jì)測定濃度，再通過SDS-PAGE鑒定純化與未純化的單克隆抗體純度。
利用(yòng)大(dà)腸杆菌原核表達系統可快(kuài)速獲得大(dà)量重組蛋白(bái)，但(dàn)由于原核表達系統表達的蛋白(bái)質修飾不完整，天然活性低(dī)，而真核表達系統表達的重組蛋白(bái)更接近于天然蛋白(bái)。這(zhè)項研究中，在制備p72重組蛋白(bái)單克隆抗體時(shí)，以大(dà)腸杆菌原核表達系統表達的p72重組蛋白(bái)作(zuò)爲免疫抗原對(duì)小(xiǎo)鼠進行免疫，再用(yòng)真核表達系統表達的p72重組蛋白(bái)進行篩選，從(cóng)而避免了(le)假陽性結果，提高(gāo)了(le)試驗結果的準确性。
通過重組蛋白(bái)表達技術制備ASFV的p72重組蛋白(bái)和(hé)使用(yòng)雜(zá)交瘤細胞技術制備抗p72蛋白(bái)的單克隆抗體，将純化後的單克隆抗體與p72兔源多克隆抗體組合并初步建立用(yòng)于檢測p72抗原的雙抗體夾心Elisa方法，可以爲建立快(kuài)速、高(gāo)效、便捷的檢測ASFV的方法提供依據。
參考文(wén)獻：
- 謝(xiè)林(lín)梅,唐子木(mù),錢(qián)新傑等.非洲豬瘟病毒p72重組蛋白(bái)單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA方法的建立[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2023(13):5-11.DOI:10.13881/j.cnki.hljxmsy.2022.05.0097.
- 楊曉紅(hóng).非洲豬瘟病毒P72基因單克隆抗體的制備及其重組杆狀病毒的構建[D].華中農(nóng)業大(dà)學,2012.DOI:10.7666/d.Y2161969.
- 石正發,馬源,袁洪,王由森,朱曉霞,車亮(liàng),李甲,羊倩倩,孫曉林(lín).非洲豬瘟病毒p72蛋白(bái)單克隆抗體的制備及阻斷ELISA方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)報(bào),2023,45(5):488-493,547.DOI:10.3969/j.issn.1008-0589.202210015.
