聯系我們
在羊駝納米抗體制備過程中，除了(le)做好(hǎo)免疫和(hé)提取外(wài)，噬菌體文(wén)庫的構建也(yě)是其核心過程之一，隻有做好(hǎo)了(le)這(zhè)個過程，才能(néng)獲得我們所需的抗體庫。那麽，在提取淋巴細胞之後，如何構建噬菌體文(wén)庫呢(ne)?今天普健生物就在這(zhè)裏和(hé)大(dà)家一一介紹。
對(duì)于不同的公司來(lái)說，納米抗體噬菌體文(wén)庫的構建是各不相同的，不過主要的區(qū)别在一些(xiē)細節流程方面，大(dà)體的制備過程如下(xià)：
1、提取RNA。将我們提取的淋巴細胞溶解後轉移至新的離心管中，加入氯仿後混勻，離心15分鐘(zhōng)後轉至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，靜置10分鐘(zhōng)後再次離心10分鐘(zhōng)後，用(yòng)75%的乙醇清晰沉澱，離心5分鐘(zhōng)後去除上(shàng)清液，而後将其溶解質無RNA酶的水(shuǐ)中;
2、轉錄cRNA。将如上(shàng)所得RNA一分爲二，轉錄成cDNA;
3、擴增。将轉錄出的cDNA擴增到(dào)特定的抗體片段中;
4、克隆至噬菌體。将擴增所得的多樣化抗體基因序列和(hé)噬菌體進行酶切，通過純化後進行鏈接反應。而後再将所得DNA純化後回收，并使用(yòng)超純水(shuǐ)進行溶解;
5、擴增和(hé)純化。将如上(shàng)所得的噬菌體鏈接物進行培養，按照輔助噬菌體數目20:1的比例加入輔助噬菌體後繼續培養30分鐘(zhōng)，加入濃度50ug/ml的卡那黴素，30度下(xià)搖床培養。所得培養的菌體離心5分鐘(zhōng)後提取上(shàng)清液，冰敷30分鐘(zhōng)後離心10分鐘(zhōng)并去除緩沖物中的溶解沉澱。再加入nacl後，冰上(shàng)孵育10分鐘(zhōng)後離心15分鐘(zhōng)，最終得到(dào)噬菌體庫;
納米抗體噬菌體文(wén)庫構建的一些(xiē)注意事(shì)項：
1、噬菌體文(wén)庫容量和(hé)多樣性是衡量文(wén)庫優質與否的重要因素，一般來(lái)說，容量越大(dà)、多樣性越好(hǎo)，構建的噬菌體文(wén)庫質量越佳;
2、在RNA提取的過程中，RNA的降解和(hé)反轉錄過程中模闆、引物及其用(yòng)量，擴增輪數、細菌轉化效率、連接體大(dà)小(xiǎo)等因素我們都需要多注意一下(xià);
總的來(lái)說，噬菌體文(wén)庫構建成功與否，提取和(hé)擴增過程都是非常重要的，如果這(zhè)幾步的操作(zuò)不成功的話(huà)，會(huì)在極大(dà)程度上(shàng)影響到(dào)抗體制備的成功與否。所以，對(duì)于我們來(lái)說，隻有做好(hǎo)這(zhè)幾個方面的工(gōng)作(zuò)，才能(néng)在更大(dà)程度上(shàng)促進實驗的完成。普健生物專業爲廣大(dà)用(yòng)戶提供噬菌體文(wén)庫構建服務，如果您有相關需求，歡迎來(lái)電咨詢。
