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一、 實驗目的
客戶通過CO-IP實驗證實A、B兩個蛋白(bái)有相互作(zuò)用(yòng)，想進一步通過體外(wài)實驗驗證，其中A蛋白(bái)大(dà)小(xiǎo)爲45kDa，親水(shuǐ)性較好(hǎo)，選用(yòng)大(dà)腸杆菌系統獲得GST-A蛋白(bái); B蛋白(bái)疏水(shuǐ)性很(hěn)強，且非常大(dà)(275kDa)，普健根據多年蛋白(bái)制備經驗，推薦客戶選擇用(yòng)昆蟲系統表達B蛋白(bái)(PS：昆蟲杆狀病毒能(néng)容納大(dà)分子的插入片段，能(néng)包裝大(dà)的基因片段)
二、 B蛋白(bái)制備流程
1、 B蛋白(bái)分析：
B蛋白(bái)一共2511AAs，無信号肽，無跨膜結構域，疏水(shuǐ)性很(hěn)強，選取1-2511AAs爲表達目的片段，C端添加6*his标簽;
(1)信号肽分析結果：
(2)疏水(shuǐ)性分析結果：
(3)跨膜區(qū)分析結果：
1、 基因優化合成B蛋白(bái)，構建pFast-bac1-B表達質粒;
2、 藍白(bái)斑篩選方法獲得重組的Bacmid，經PCR鑒定陽性後，轉染sf9細胞，獲得P1代病毒粒子，通過P1代表達測試，鑒定是否有目的蛋白(bái)表達;
3、 生産P2代病毒粒子，進行MOI測試，選最優條件進行200ml放(fàng)大(dà)及純化，獲得目的蛋白(bái);
三、 實驗結果
圖1：P1代表達測試結果
A. 考馬斯亮(liàng)藍染色. B. His 标簽抗體WB鑒定蛋白(bái) (ECL曝光).
圖2：P2代MOI測試結果
考馬斯亮(liàng)藍染色
圖3：樣品純化後QC結果
A.考馬斯亮(liàng)藍染色. B. His 标簽抗體WB鑒定蛋白(bái) (ECL曝光).
實驗結果分析：
SDS-PAGE結果顯示260kDa左右有條帶，通過His 标簽，WB檢測曝出與目的蛋白(bái)大(dà)小(xiǎo)一緻的條帶，說明(míng)SDS-PAGE膠上(shàng)的條帶爲目的蛋白(bái)條帶，蛋白(bái)純度爲90%。
蛋白(bái)表達量爲：200ml可純化到(dào)1.8mg His-B蛋白(bái)
圖4：GST-A蛋白(bái)與HIS-B蛋白(bái)GST pull down實驗結果
結論：GST-A蛋白(bái)與His-B蛋白(bái)是有相互作(zuò)用(yòng)的。
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