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采用(yòng)大(dà)腸杆菌表達蛋白(bái)是現(xiàn)階段使用(yòng)非常廣泛的一項技術，我們一般将這(zhè)種方法稱爲原核表達。這(zhè)個方法的使用(yòng)範圍非常的廣泛，比如在蛋白(bái)純化、定位以及相關蛋白(bái)功能(néng)分析等。因爲大(dà)腸杆菌易于控制和(hé)生長，而且價格相對(duì)便宜，使得其使用(yòng)極爲廣泛。
大(dà)腸杆菌蛋白(bái)表達時(shí)，常常會(huì)使用(yòng)載體(通常爲質粒)來(lái)表達目的蛋白(bái)。原核表達通常按照：獲得目的蛋白(bái)、構建表達載體、插入目的基因、培養宿主菌、誘導蛋白(bái)表達、蛋白(bái)分析，最後通過擴增、純化等操作(zuò)後，進行進一步檢測;
其具體操作(zuò)步驟如下(xià)：
1、獲得目的基因
獲得目的基因的方法主要有兩種，一種是PCR方法，一種是RT-PCR方法，另外(wài)一種是人工(gōng)合成法。
PCR法：以含有目的基因的克隆質粒爲模闆，通過基因序列設計(jì)一對(duì)引物，從(cóng)而獲得基因片段;
RT-PCR法：從(cóng)細胞或組織中提取RNA，而後以RNA逆轉錄出cDNA第一鏈，而後以逆轉錄爲模闆獲得目的基因;
人工(gōng)合成法：通過檢測到(dào)的目的基因序列，合成重疊的單鏈寡合苷酸，而後通過重疊延伸PCR法拼接出全長;
2、構建表達載體
使用(yòng)限制性内切酶将質粒進行雙酶切，而後對(duì)酶切的産物進行瓊脂糖電泳，從(cóng)而獲得載體大(dà)片段，而後通過相關技術手段将目的基因連入載體;
3、質粒構建
将連接産物轉入大(dà)腸杆菌，而後對(duì)相關細菌進行挑選，再然後通過裂解法提取質粒，最後檢測目的基因的插入方向并論證其正确性;
4、誘導表達
對(duì)含有目的基因的菌體進行培養，而後取部分液體與未誘導組進行對(duì)照，培養完成後，離心後取上(shàng)清液作(zuò)爲樣品;
大(dà)腸杆菌蛋白(bái)表達的注意事(shì)項有哪些(xiē)?
1、在我們選擇表達載體時(shí)，一定要根據蛋白(bái)的最終應用(yòng)來(lái)進行選擇;
2、在進行外(wài)源DNA連接時(shí)，需要确保其轉錄與轉移過程中不會(huì)出現(xiàn)相互幹擾的情況;
大(dà)腸杆菌蛋白(bái)表達作(zuò)爲現(xiàn)階段使用(yòng)最爲廣泛的原核蛋白(bái)表達系統，因爲其遺傳背景清晰的優勢，在蛋白(bái)表達上(shàng)有着極大(dà)的優勢。在進行相關蛋白(bái)表達時(shí)，需要嚴格按照實驗标準來(lái)操作(zuò)，這(zhè)樣才能(néng)在更大(dà)程度上(shàng)保證蛋白(bái)的表達。武漢普健生物專業爲廣大(dà)用(yòng)戶提供原核蛋白(bái)表達服務，如果您有相關需求，歡迎來(lái)電咨詢。
