哺乳動物細胞蛋白(bái)表達案例

一、實驗設計(jì)

　　根據客戶的預期蛋白(bái)量、純度以及蛋白(bái)用(yòng)途等需求，通過哺乳系統來(lái)分泌表達純化目的蛋白(bái)。設計(jì)思路爲：密碼子優化最适宜哺乳系統的基因序列，将目的蛋白(bái)序列構建到(dào)普健生物自(zì)主研發的高(gāo)效表達載體pATX2，N端添加哺乳系統常用(yòng)信号肽利于分泌表達，C端添加His标簽，便于蛋白(bái)的檢測和(hé)親和(hé)純化，瞬時(shí)轉染哺乳細胞HEK293，通過SDS-PAGE檢測蛋白(bái)表達情況，收集培養基部分用(yòng)鎳柱親和(hé)純化獲得目的蛋白(bái)。

二、蛋白(bái)性質分析

　　2.1信号肽分析

　　2.2疏水(shuǐ)性分析

　　2.3跨膜結構域分析

　　綜上(shàng)所述：

　　1.目的蛋白(bái)理(lǐ)論分子量爲 43KDa，适宜表達。

　　2.對(duì)蛋白(bái)的信号肽，跨膜結構域和(hé)親疏水(shuǐ)性分析，蛋白(bái)整體疏水(shuǐ)性略強。

　　3.目的蛋白(bái)自(zì)身無信号肽，添加哺乳系統常用(yòng)信号肽，利于蛋白(bái)分泌表達。

　　4.在C端添加His标簽，便于蛋白(bái)的檢測和(hé)親和(hé)純化。

三、實驗方法

　　3.1 轉染前一天，接種細胞到(dào)完全培養基中培養，使細胞在轉染當天處于對(duì)數生長期。

　　3.2 轉染複合物的準備。

　　3.3 轉染：加入轉染混合物到(dào)細胞懸液中，輕柔混勻後培養至細胞活率降到(dào)50%以下(xià)收樣。

　　3.4 收集表達後的細胞液，将培養基上(shàng)清标記爲culture medium;細胞加入1×PBS混勻，超聲後離心，上(shàng)清吸至新的EP管中，标記爲NPE，沉澱加入1×PBS(含8M尿素)，混勻，标記爲DPE。

　　3.5 鎳柱親和(hé)純化：

　　3.5.1 用(yòng)PBS，pH 7.5緩沖液平衡鎳柱，以0.5 ml/min流速上(shàng)樣;

　　3.5.2 用(yòng)Wash-Buffer以1 ml/min流速沖洗;

　　3.5.3 用(yòng)Elution-Buffer以1 ml/min流速洗脫目的蛋白(bái)，收集流出液;

　　3.5.4 将上(shàng)述收集的蛋白(bái)溶液放(fàng)入透析袋中，使用(yòng)PBS(pH 7.5)進行透析過夜;

　　3.5.5 進行SDS-PAGE分析。

四、實驗結果

　　4.1 蛋白(bái)鎳柱親和(hé)純化樣品SDS-PAGE分析：

　　4.2純化後樣品濃縮透析之後進行SDS-PAGE分析：

　　結論：目的蛋白(bái)已成功表達純化，并且純化得到(dào)的蛋白(bái)純度較高(gāo)，在90%以上(shàng)。

五、樣品信息

六、結論

　　目的蛋白(bái)表達量爲62.5 mg/L, 純度大(dà)于90%。

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